Peter Sarnow၊ Stanford University School of Medicine၊ Stanford University၊ California၊ 2020 ခုနှစ် ဒီဇင်ဘာလ 25 ရက်နေ့တွင် အတည်ပြုခဲ့သည် (အောက်တိုဘာ 25၊ 2020 တွင် ပြန်လည်သုံးသပ်သည်)
ပုံတူပွားခြင်းနှင့် ဆင့်ကဲထိန်းသိမ်းခြင်းအတွက် မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်စ်-ကူးယူခြင်းဆိုင်ရာ ရှုပ်ထွေးမှုများ၏ ပုံတူပွားမှုတွင် ယူနစ်ခွဲများကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့ အစီရင်ခံပါသည်။nsp12 နှင့်ဆက်စပ်နေသော NiRAN ဒိုမိန်းတွင် မျဉ်းပြောင်းတွင် nucleoside monophosphate (NMP) transferase လှုပ်ရှားမှုရှိကြောင်း အထောက်အထားများပေးပြီး nsp9 (RNA binding protein) ကို ၎င်း၏ပစ်မှတ်အဖြစ် သတ်မှတ်ခဲ့သည်။NiRAN သည် Mn2+ အိုင်းယွန်းများနှင့် ကပ်လျက်ထိန်းသိမ်းထားသော Asn အကြွင်းအကျန်များအပေါ် မှီခိုသော တုံ့ပြန်မှုတစ်ခုတွင် ထိန်းသိမ်းထားသော nsp9 အမိုင်နို terminus သို့ NMP moiety ၏ covalent ပူးတွဲမှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်။NiRAN လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် nsp9 NMPylation တို့သည် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်ပွားခြင်းအတွက် မရှိမဖြစ်လိုအပ်ကြောင်း တွေ့ရှိရပါသည်။ဒေတာများသည် ကျွန်ုပ်တို့အား RNA ဗိုင်းရပ်စ်အတန်းအစားတွင် လုပ်ဆောင်နိုင်စွမ်းရှိပြီး ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်အရ တသမတ်တည်းဖြစ်သည်ဟူသော ယူဆချက်တွင် ယခင်လေ့လာတွေ့ရှိချက်များနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော ဗိုင်းရပ်စ်ပိုးများ၏ ဤလုပ်ဆောင်ချက်ကို ဒေတာက ချိတ်ဆက်နိုင်စေပါသည်။
Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae နှင့် အခြားမိသားစု 12 ခု) ၏ RNA-မှီခို RNA polymerase (RdRps) သည် NiRAN ဟုခေါ်သော ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံမဟုတ်သော ပရိုတင်း (nsp) အတွင်းရှိ အမိုင်နို-တာမီနယ် (N-terminal) ဒိုမိန်းနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။ 1ab သည် ဗိုင်းရပ်စ် အဓိက ပရိုတင်း (Mpro) နှင့် ဖွဲ့စည်းထားသည်။ယခင်က၊ သွေးလွှတ်ကြောဗိုင်းရပ်စ် NiRAN-RdRp nsp ၏ကိုယ်ပိုင် GMPylation/UMPylation လုပ်ဆောင်ချက်ကို အစီရင်ခံခဲ့ပြီး၊ nucleoside monophosphate (NMP) ၏ (လောလောဆယ်မသိရသေးသော) ဗိုင်းရပ်စ်နှင့်/သို့မဟုတ် ဆဲလ် biopolymerization အရာများထံ လွှဲပြောင်းခြင်းအတွက် ယာယီထုတ်လုပ်ရန် အကြံပြုခဲ့သည်။ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် (Human Coronavirus [HCoV]-229E နှင့် Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) တွင် Mn2+-dependent NMPylation လုပ်ဆောင်ချက်ရှိပြီး၊ ၎င်းသည် nsp9 မှဆင်းသက်လာသော Mpro-mediated nsp9 ၏ဖွဲ့စည်းမှုပြီးနောက်၊ N-terminal flanking nsps ကို ပရိုတီအိုလစ်နည်းဖြင့် ထုတ်လွှတ်သည်၊ phosphoramidate ကို nsp9 ၏ N-terminal တွင် primary amine (N3825) နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။Uridine triphosphate သည် ဤတုံ့ပြန်မှုတွင် ဦးစားပေး nucleotide ဖြစ်သော်လည်း adenosine triphosphate၊ guanosine triphosphate နှင့် cytidine triphosphate တို့သည် သင့်လျော်သော တွဲဖက်အလွှာများဖြစ်သည်။ပြန်လည်ပေါင်းစည်းထားသော ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်စ် nsp9 နှင့် nsp12 ပရိုတင်းများနှင့် မျိုးဗီဇအင်ဂျင်နီယာဆိုင်ရာ HCoV-229E ဗီဇပြောင်းခြင်းများကို အသုံးပြု၍ ဗီဇပြောင်းခြင်းဆိုင်ရာလေ့လာမှုများက NiRAN-mediated nsp9 NMPylation နှင့် ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုရှိ ဗိုင်းရပ်စ်မျိုးပွားမှုအတွက် လိုအပ်သောအကြွင်းအကျန်များကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ဒေတာသည် NiRAN တက်ကြွသောဆိုက်အကြွင်းအကျန်များ၏ ခန့်မှန်းမှုကို အတည်ပြုခဲ့ပြီး nsp9 NMPylation နှင့် ဗိုင်းရပ်စ်မျိုးပွားခြင်းအတွက် vitro တွင် nsp9 N3826 အကြွင်းအကျန်များ၏ အရေးကြီးသောအခန်းကဏ္ဍကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ဤအကြွင်းအကျန်သည် ထိန်းသိမ်းထားသော N-terminal NNE tripeptide အစီအစဉ်၏ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းဖြစ်ပြီး nsp9 ၏ တစ်ခုတည်းသော မူကွဲအကြွင်းအကျန်များနှင့် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်မိသားစုရှိ ၎င်း၏ homologs များဖြစ်သည်။ဤလေ့လာမှုသည် အခြားသော အသိုက်အဝန်းရှိ ဗိုင်းရပ်စ်များ၏ NMPylation လုပ်ဆောင်ချက်ကို လေ့လာခြင်းအတွက် ခိုင်မာသော အခြေခံအုတ်မြစ်ကို ထောက်ပံ့ပေးပြီး ဗိုင်းရပ်စ်ပိုးသတ်ဆေးများ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွက် ဖြစ်နိုင်သော ပစ်မှတ်များကို အဆိုပြုပါသည်။
Nidovirales positive-stranded RNA ဗိုင်းရပ်စ်သည် ကျောရိုးရှိသတ္တဝါများနှင့် ကျောရိုးမဲ့သတ္တဝါမျိုးစုံကို ကူးစက်သည် (၁၊ ၂)။လက်ရှိအမှာစာတွင် မိသားစု (၃) စုပါဝင်ပြီး ၎င်းတို့တွင် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်မိသားစုသည် လွန်ခဲ့သည့်နှစ် (၂၀) အတွင်း အကျယ်တဝင့်လေ့လာခဲ့သည်။ထိုအချိန်တွင်၊ zoonotic ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် ၃ မျိုးသည် တိရိစ္ဆာန်အိမ်ရှင်များထံမှ ထွက်ပေါ်လာပြီး လူသားများတွင် ပြင်းထန်အသက်ရှူလမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ရောဂါပိုးများ အကြီးအကျယ်ဖြစ်ပွားစေခဲ့သည်။ပြင်းထန်ပြင်းထန်သော ကူးစက်ရောဂါများကြောင့် ဖြစ်ပွားတတ်သော ကပ်ရောဂါများ ပါဝင်သည်။Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7)။Nidoviruses သည် ယေဘူယျ ဂျီနိုမ်အဖွဲ့အစည်းကို မျှဝေထားပြီး၊ အမြှေးပါးပုံတူပွား-ကူးယူခြင်းရှုပ်ထွေးသော (RTC) ၏ အခွဲအပိုင်းကို 5-?²-terminal သုံးပုံနှစ်ပုံနှင့် ဗိုင်းရပ်စ်အမှုန်အမွှား၏ အဓိကဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာခွဲယူနစ်အပြင် ဆက်စပ်ပစ္စည်းအချို့၊ .ဂျီနိုမ် (1) ၏ 3??² အဆုံးတွင် ကုဒ်လုပ်ထားသော ပရိုတင်း။Planarian viruses (Monoviridae) (8) မျိုးမှလွဲ၍ ကျန်ဗိုင်းရပ်စ်များသည် RTC subunits များကို genomic RNA မှ ဘာသာပြန်သည့် ကြီးမားသောအဖွင့်စာဖတ်ဘောင် (ORF) ORF1a နှင့် ORF1b နှစ်ခုတွင် ကုဒ်လုပ်ထားပါသည်။ORF1a သည် polyprotein (pp) 1a ကို ကုဒ်လုပ်ပြီး ORF1a နှင့် ORF1b တို့က pp1ab ကို ပူးတွဲကုဒ်လုပ်သည်။ORF1a မှ ကုဒ်လုပ်ထားသော ပင်မပရိုတင်း (Mpro) ၏ ယေဘူယျပါဝင်မှုနှင့်အတူ၊ pp1a နှင့် pp1ab နှစ်မျိုးလုံးကို ပရိုတီအိုလီစနစ်ဖြင့် 3CLpro ဟုလည်းသိကြသော အမျိုးမျိုးသောဖွဲ့စည်းပုံမဟုတ်သောပရိုတိန်းများ (nsps) အဖြစ်သို့ အဆင့်ဆင့်လုပ်ဆောင်ကြသည်၊ ၉)။ဤ nsps များကို ကြီးမားသော ရွေ့လျား RTC အဖြစ် စုစည်းပြီး genomic RNA (replication) နှင့် subgenomic RNA (ဘာသာပြန်ခြင်း) အစုအဝေးကို လှုံ့ဆော်ပေးပြီး ORF1b (10 ?? ?၁၂)။
core RTC တွင် RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (13)၊ superfamily 1 helicase (HEL1) (14, 15) နှင့် RNA processing enzymes အများအပြားပါဝင်ပြီး၊ အဓိကအားဖြင့် ORF1b တွင် encode လုပ်ထားသော နှင့် coronavirus မိသားစုတွင် ၎င်းတွင် nsp12-nsp16 နှင့် Arterioviridae မိသားစုတွင် nsp9-nsp12 (ကိုးကား 10ââ 12 ကိုကြည့်ပါ)။RdRp နှင့် HEL1 သည် ငှက်သိုက်ဗိုင်းရပ်စ်၏ ထိန်းသိမ်းထားသော ဒိုမိန်းနှစ်ခု (ငါးပုံတစ်ပုံ) ကို ကိုယ်စားပြုပြီး အခြား RNA ဗိုင်းရပ်စ်များကြားတွင် တူညီမှုရှိသည်။Core ပုံစံတူခြင်းကို pp1a ၏ carboxy-terminal (C-terminal) ဒေသ၊ Mpro (coronavirus nsp5 နှင့် arterial virus nsp4 အသီးသီး) မှ ထုတ်လွှတ်သော nsps ငယ်များစွာ အပါအဝင် အခြားသော ယူနစ်ခွဲများက ကူညီပေးသည်ဟု ယူဆရသည်။၎င်းတို့တွင် မိသားစုအလိုက် အကာအကွယ်ပေးခြင်းနှင့် မတူကွဲပြားသော လုပ်ဆောင်မှုများ အကန့်အသတ်ရှိသည် (ကိုးကား 10âââ12 တွင် ပြန်လည်သုံးသပ်သည်)။
မကြာသေးမီက၊ ထူးခြားသော sequence motif လက္ခဏာများရှိသော ဒိုမိန်းတစ်ခုကို RdRp နှင့်ကပ်လျက်ရှိသော အမိုင်နို terminus (N-terminus) တွင် nested viruses များအားလုံးတွင် တွေ့ရှိသော်လည်း အခြား RNA virus (16) မရှိပါ။၎င်း၏တည်နေရာနှင့် nucleotide transferase (nucleoside monophosphate [NMP] transferase) လုပ်ဆောင်ချက်အပေါ် အခြေခံ၍ ဤဒိုမိန်းအား NiRAN (Nestvirus RdRp-related nucleotide transferase) ဟုခေါ်သည်။NiRAN-RdRp ၏ dual-domain ပေါင်းစပ်မှုသည် Coronaviridae မိသားစုတွင် nsp12 နှင့် Arterioviridae မိသားစုတွင် nsp9 နှင့် အခြား nestoviridae တွင် NiRAN-RdRp သည် ဗိုင်းရပ်စ် polyprotein မှ သီးခြား NSP အဖြစ် ထွက်ရှိလာမည်ဟု မျှော်လင့်ရသည်။ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်တွင်၊ NiRAN ဒိုမိန်းတွင် ??1/450 အကြွင်းအကျန်များ ပါ၀င်ပြီး C-terminal RdRp ဒိုမိန်းနှင့် ချိတ်ဆက်သူဒေသ (16?19) မှတဆင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။Equine Arteritis Virus (EAV) (Arteriviridae) တွင် recombinant nsp9 သည် nestovirus၊ AN၊ BN နှင့် CN တို့တွင် သိမ်းဆည်းထားသော အစီအစဥ်သုံးရပ်အပေါ် မူတည်ပြီး အဆိုပါ အကြွင်းအကျန်များကို စီစဥ်ရှိ အကြွင်းအကျန်များပေါ်တွင် မူတည်သော Mn2+ ion-dependent (self) UMPylation နှင့် GMPylation ကို ပြသသည်။N သည် NiRAN ကို ကိုယ်စားပြုသည်) (၁၆)။ဤ motifs များ၏ N-terminal ဘေးချင်းကပ်နေသည်မှာ ရှေးရိုးဆန်သော preAN နည်းဖြစ်သည်။ဤအကြွင်းအကျန်အချို့ကိုလည်း ဝေးကွာသောဆက်စပ်ပရိုတိန်း kinases တွင် ထိန်းသိမ်းထားပြီး၊ ၎င်းတို့သည် nucleoside triphosphate (NTP) binding နှင့် catalytic activity (20၊ 21) တွင် ပါဝင်ကြောင်းပြသထားသည်။ဤလေ့လာတွေ့ရှိချက်နှင့်အညီ၊ Pseudomonas syringae မှ pseudokinase SelO အတွင်းရှိ အဓိကတက်ကြွသောဆိုက်အကြွင်းအကျန်အများအပြားကို မကြာသေးမီကထုတ်ဝေထားသော SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 supercomplex ဖြင့် စုစည်းနိုင်သည်။အီလက်ထရွန်အသေးစားဖွဲ့စည်းပုံတွင် ထည့်သွင်းထားသော Coronavirus NiRAN အကြွင်းအကျန်များကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။Recombinant ပရိုတင်း (၁၇)။မှတ်တမ်းတင်ထားသော (ကိုယ်တိုင်) U/GMPylation သည် NMP ကို (လောလောဆယ်မသိရသေးသော) အလွှာ (16) သို့လွှဲပြောင်းရန် ယာယီအခြေအနေတစ်ခုထုတ်လုပ်မည်ဖြစ်ပြီး NiRAN နှင့် ပရိုတိန်း kinase (17, 19) အကြားဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာဆင်တူမှုဟုယူဆချက်ဖြစ်သည်၊ NiRAN သည် အခြားသော ပရိုတင်းများကို ပြုပြင်သည်။
သိုက်ဗိုင်းရပ်များနှင့် RdRp မှ မျိုးရိုးဗီဇခွဲခြားမှုများနှင့် ၎င်း၏ထူးခြားထူးခြားသောစနစ်တကျဆက်စပ်မှု အပါအဝင် အင်္ဂါရပ်များစွာသည် NiRAN သည် ၎င်းတို့၏ပေါ်ပေါက်လာမှုနှင့် အထောက်အထားအတွက် အရေးကြီးသည့် အသိုက်အမြုံဗိုင်းရပ်စ်များအတွက် ကျိုးကြောင်းဆီလျော်သော အဓိကကျသော စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းအင်ဇိုင်းတစ်ခု ဖြစ်စေသည်။ယခင်က၊ NiRAN ပါ၀င်သော ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော လုပ်ဆောင်ချက်များ သုံးခုကို ဂျီနိုမ်/မျိုးရိုးဗီဇဘာသာပြန်ဆိုမှု သို့မဟုတ် ကူးယူခြင်း/ကူးယူဖော်ပြခြင်းကို ထိန်းညှိရန် ခေါ်သည်။ထိုအချိန်တွင် ရရှိနိုင်သော ရှားပါးပြီး မပြည့်စုံသော အချက်အလက်များကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားသောအခါ၊ လုပ်ဆောင်ချက်တစ်ခုစီတွင် ၎င်း၏ အားသာချက်များနှင့် အားနည်းချက်များ (၁၆) ခုရှိသည်။ဤသုတေသနတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် မျိုးဗီဇနှစ်ခုကို ကိုယ်စားပြုသည့် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်များ၏ ဇီဝဓာတုနှင့် ပြောင်းပြန်မျိုးရိုးဗီဇလေ့လာမှုများကို ပေါင်းစပ်ကာ၊ ဤလျှို့ဝှက်ဆန်းကြယ်သောနယ်ပယ်ကို ထိုးထွင်းသိမြင်နိုင်စေရန်အတွက် ကျွန်ုပ်တို့၏တွေ့ရှိချက်များကို ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်မိသားစု၏ ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်နောက်ခံတွင် ထည့်သွင်းထားသည်။RTC ရှိ သဘာဝပစ်မှတ်များကို ဖော်ထုတ်ခြင်းမှတစ်ဆင့် NiRAN ၏ နားလည်မှုတွင် ကြီးမားသောတိုးတက်မှုများကို အစီရင်ခံတင်ပြသည်မှာ (ရရှိနိုင်သည့် ယူဆချက် သုံးခုအနက်) သည် nested virus RNA ၏ပေါင်းစပ်မှုကို စတင်ရာတွင် ဤဒိုမိန်း၏အခန်းကဏ္ဍကို အထောက်အကူဖြစ်စေပါသည်။ဤသုတေသနသည် virus host interface တွင် NiRAN ၏အခြားအခန်းကဏ္ဍများအတွက်ဖြစ်နိုင်ချေများကိုဖွင့်ပေးသည်။
ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် nsp12 နှင့်ဆက်စပ်သော NiRAN ဒိုမိန်း၏ အင်ဇိုင်းဂုဏ်သတ္တိများကို လက္ခဏာရပ်ပြရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် လူသားကိုရိုနာဗိုင်းရပ် 229E (HCoV-229E) nsp12 ကို C-terminus တွင် His6 တက်ဂ်ဖြင့် C-terminus တွင် ပေါင်းစပ်ထုတ်လုပ်ပြီး၊ ပစ္စည်းများနှင့် နည်းလမ်းများတွင် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း MnCl2 ၏ရှေ့မှောက်တွင် NTP နှင့် [α32-P] ပါသော ပရိုတင်းကို ပေါက်ဖွားခြင်း။တုံ့ပြန်မှုထုတ်ကုန်၏ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် nsp12 (106 kDa) နှင့် ရွှေ့ပြောင်းခြင်းတွင် ရေဒီယိုတံဆိပ်ပါသော ပရိုတိန်းပါဝင်မှုကို ညွှန်ပြသည်) ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် nsp12 သည် uridine monophosphate (UMP) (ပုံ 1A) နှင့် ဦးစားပေးဖွဲ့စည်းထားသော covalent ပရိုတင်း-NMP adducts များကို လှုံ့ဆော်ပေးသည်၊ ခ)။အခြားသော နျူကလီးအိုရိုက်များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက UMP ပေါင်းစပ်မှု၏ အချက်ပြပြင်းထန်မှုသည် ၂ ဆမှ ၃ ဆအထိ တိုးလာကြောင်း ပြသခဲ့သည် (ပုံ 1C)။ဤဒေတာသည် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် (16) ၏ NiRAN ဒိုမိန်း၏ ခန့်မှန်းထားသည့် NMP transferase လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် ကိုက်ညီသော်လည်း ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်၏ NiRAN ဒိုမိန်း၏ နျူကလိယိုအကြိုက်များနှင့် သွေးလွှတ်ကြောဗိုင်းရပ်စ်သည် ကွဲပြားကြောင်း ညွှန်ပြနေသည်။
HCoV-229E nsp12 ၏ ကိုယ်ပိုင် NMPylation လုပ်ဆောင်မှု။(က) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) ကို 6 mM MnCl2 ၏ရှေ့မှောက်တွင် သတ်မှတ်ထားသော [α-32P] NTP ဖြင့် ပေါက်ဖွားခဲ့သည် (အသေးစိတ်အချက်အလက်များအတွက် ပစ္စည်းများနှင့် နည်းလမ်းများကို ကြည့်ပါ)။တုံ့ပြန်မှုထုတ်ကုန်များကို SDS-PAGE ဖြင့် ခွဲခြားထားပြီး Coomassie တောက်ပသောအပြာရောင်ဖြင့် စွန်းထင်းခဲ့သည်။(ခ) ရေဒီယိုဓာတ်ပါသော ပရိုတင်းဓာတ်ကို ဖော့စဖရပ်ပုံဖြင့် မြင်နိုင်သည်။nsp12-His6 နှင့် ပရိုတိန်းမော်လီကျူးဒြပ်ထု၏ တည်နေရာများကို A နှင့် B (C) တွင် ပြသထားသည်။ (C) ရေဒီယိုသတ္တိကြွအချက်ပြမှု (ပျမ်းမျှ ± SEM) ၏ ပြင်းထန်မှုကို သီးခြားလွတ်လပ်သော စမ်းသပ်မှု သုံးခုမှ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။*P≤0.05။အချက်ပြခွန်အား (ရာခိုင်နှုန်း) သည် UTP နှင့် ဆက်စပ်နေသည်။
NiRAN နှင့်ဆက်စပ်သော အင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်ချက်များသည် ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှု (16) တွင် EAV နှင့် SARS-CoV မျိုးပွားမှုအတွက် မရှိမဖြစ်လိုအပ်ကြောင်းပြသခဲ့သော်လည်း၊ တိကျသော NiRAN လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် အလားအလာရှိသော ပစ်မှတ်များကို မဆုံးဖြတ်ရသေးပါ။NiRAN နှင့် ပရိုတိန်း kinase ကဲ့သို့သော ခေါက်များရှိသော ပရိုတင်းမိသားစု (17, 22) အကြား ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ တူညီမှုသည် NiRAN သည် အခြားပရိုတင်းများ၏ NMPylation ကို ဓာတ်ကူပေးသည်ဟူသော ယူဆချက်ကို စမ်းသပ်ရန် ကျွန်ုပ်တို့အား လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့သည်။HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) မှ C-terminal His6 တဂ် (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ဇယား S1) ပါဝင်သော ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံမဟုတ်သော ပရိုတိန်းများ အပါအဝင် ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော တူညီသောပစ်မှတ်များအစုအဝေးကို ကျွန်ုပ်တို့ ထုတ်ပေးခဲ့ပြီး၊ ဤပရိုတိန်းများကို [α32-P] uridine triphosphate ([α32-P]UTP) နှင့် nsp12 မပါရှိခြင်း သို့မဟုတ် သားဖောက်ပါ။Bovine serum albumin နှင့် MBP-LacZα ပေါင်းစပ်ထားသည့် E. coli တွင် ထုတ်လုပ်သော ပရိုတင်းများကို ထိန်းချုပ်မှုများအဖြစ် ဆောင်ရွက်ခဲ့သည် (ပုံ 2A၊ လမ်းသွား 1 မှ 7)။ရေဒီယိုဓာတ်တံဆိပ်တပ်ထားသော ပရိုတိန်းကို ဆိုဒီယမ်ဒိုဒီစီလီဆာလ်ဖာ-ပိုလီအက်ခရီလာမိုက်ဂျယ် အီလက်ထရိုဖိုရစစ် (SDS-PAGE) နှင့် autoradiography ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး nsp12 နှင့် nsp9 ပါဝင်သော တုံ့ပြန်မှုတွင် ပြင်းထန်သော ရေဒီယိုသတ္တိကြွအချက်ပြမှုရှိကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည်။အချက်ပြ၏ အနေအထားသည် nsp9 ၏ မော်လီကျူးဒြပ်ထုနှင့် သက်ဆိုင်ပြီး nsp12-mediated UMPylation (ပုံ 2B၊ အပုဒ် 7) ကို ညွှန်ပြသည်။အခြားစမ်းသပ်ပရိုတိန်းများကို UMPylated မတွေ့ခဲ့ဘဲ၊ ၎င်းသည် nsp9 သည် nsp12 ၏ သီးခြားအလွှာတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း ကောက်ချက်ချနိုင်စေသည်။ပုံ 1 တွင်ပြသထားသော self-NMPylation ဒေတာနှင့်ကိုက်ညီသော၊ nsp12 သည် NMPs လေးခုလုံးကို nsp9 သို့လွှဲပြောင်းနိုင်သည်၊ ထိရောက်မှုကွာခြားသော်လည်း UMP > adenosine monophosphate (AMP) > guanosine monophosphate (GMP) > cytidine monophosphate (CMP) ( ပုံ)။3 A နှင့် B) ။ဤစစ်ဆေးမှုတွင်အသုံးပြုသည့်အခြေအနေများအောက်တွင် (တုံ့ပြန်မှုနှင့်ထိတွေ့မှုအချိန်ကိုတိုစေသည်၊ nsp12 ၏အာရုံစူးစိုက်မှုကိုလျှော့ချပါ၊ ပစ္စည်းများနှင့်နည်းလမ်းများ)၊ nsp12 ၏ကိုယ်ပိုင် NMPylation ကိုရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်မည်မဟုတ်ပါ (ပုံ 2B၊ လမ်းသွား 7၊ နှင့် ပုံ 1B တို့ကိုနှိုင်းယှဉ်ပါ)၊ ထိရောက်မှု (များစွာသော အကြိမ်များ) UMP ကို nsp12 မှ nsp9 သို့ ပြောင်းခဲ့သည် ။UMP transferase လုပ်ဆောင်ချက်သည် ပုံ 3C တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း Mn2+ အိုင်းယွန်းများရှိနေရန် လိုအပ်ပြီး Mg2+ ၏ရှေ့မှောက်တွင် အနည်းငယ်သာ UMP transferase လုပ်ဆောင်ချက်ကို တွေ့ရှိရပြီး အခြားကွဲပြားသည့် cations နှစ်ခု၏ရှေ့မှောက်တွင် လှုပ်ရှားမှုမရှိပေ။cytidine triphosphate (CTP)၊ guanosine triphosphate (GTP) နှင့် adenosine triphosphate (ATP) (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S1) ပါ၀င်သော NMPylation စစ်ဆေးမှုတွင် အလားတူဒေတာကို ရရှိခဲ့ပါသည်။
nsp9 ၏ HCoV-229E nsp12-mediated UMPylationHCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated ၏ UMPylation လုပ်ဆောင်ချက်ကို အကဲဖြတ်ရန် ပရိုတင်းအလွှာများ၏ စီးရီးတစ်ခု (MBP-lacZα၊ နှင့် C-terminal His6 ဖြင့် တံဆိပ်တပ်ထားသော HCoV-229E nsps စီးရီးတစ်ခု) ကို HCoV-229E nsp12-His6⁺-mediated ၏ UMPylation လုပ်ဆောင်ချက်ကို အကဲဖြတ်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ပရိုတင်း။ပစ္စည်းများနှင့် နည်းလမ်းများတွင် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း nsp12 မရှိခြင်း (A) သို့မဟုတ် တည်ရှိခြင်း (B) (B) တွင် [α-32P] UTP ဖြင့် 10 မိနစ်ကြာ ဖုတ်ပေးပါ။A နှင့် B ၏ထိပ်တွင် Coomassie Brilliant Blue ဖြင့်စွန်းထင်းနေသော SDS-polyacrylamide ဂျယ်ကိုပြသထားပြီး A နှင့် B ၏အောက်ခြေတွင်သက်ဆိုင်ရာအော်တိုရေဒီယိုဂရမ်များကိုပြသထားသည်။ပရိုတင်းမော်လီကျူးအစုလိုက်အပြုံလိုက် အမှတ်အသား (ကီလိုဒယ်လ်တန်) ၏ အနေအထားကို ဘယ်ဘက်တွင် ပေးထားသည်။nsp12-His6 (B, top) နှင့် nsp9-His6 (B, Lane 7) ဖြင့် nsp12-His6 ပေါက်ဖွားစဉ်တွင် တွေ့ရသော ရေဒီယိုသတ္တိကြွ အချက်ပြ တည်နေရာကိုလည်း ညွှန်ပြသည်၊၊ ၎င်းသည် [α-32P]UMP မှ nsp9-His6 (12.9 kDa) သည် အခြားသော ပရိုတင်းများကို စမ်းသပ်စစ်ဆေးခြင်းအတွက် သတိပြုမိခြင်းမရှိပါ။
HCoV-229E NiRAN-mediated ဇီဝဓာတုနှင့် nsp9 NMPylation ၏ ဗိုင်းရပ်စ်ဆိုင်ရာ လက္ခဏာရပ်များ။(A နှင့် B) တုံ့ပြန်မှုတွင် အသုံးပြုသည့် နျူကလီးအိုရိုက် ပူးတွဲအလွှာ၏ အခန်းကဏ္ဍ။Nsp12-His6 နှင့် nsp9-His6 ကို စံ NMPylation ဆန်းစစ်မှုတွင် မတူညီသော [α-32P] NTPs များထံတွင် ရောနှောပြီး ပေါက်ဖွားသည်။(က၊ ထိပ်) SDS-PAGE ဖြင့် ပိုင်းခြားထားသော Coomassie-stained nsp9-His6။(က၊ အောက်ခြေ) ဂျယ်၏တူညီသောဧရိယာ၏ Autoradiograph ။(ခ) သတ်မှတ်ထားသော nucleotide cofactor ၏ရှေ့မှောက်တွင် နှိုင်းရလှုပ်ရှားမှု (ပျမ်းမျှ ± SEM) ကို သီးခြားလွတ်လပ်သော စမ်းသပ်မှု သုံးခုမှ ဆုံးဖြတ်သည်။*P≤0.05။(ဂ) သတ္တုအိုင်းယွန်းများ၏ အခန်းကဏ္ဍ။ပြသည်မှာ [α-32P] UTP နှင့် မတူညီသောသတ္တုအိုင်းယွန်းများပါဝင်မှုတွင် စံ NMPylation စမ်းသပ်မှုဖြစ်ပြီး တစ်ခုစီတွင် 1 mM ရှိသည်။C တွင်၊ ထိပ်တွင် Coomassie စွန်းထင်းနေသော nsp9-His6 ကိုပြသထားပြီး C တွင်၊ အောက်ခြေတွင် သက်ဆိုင်ရာ autoradiography ကိုပြသထားသည်။တံဆိပ်တပ်ထားသော ပရိုတိန်း၏အရွယ်အစား (ကီလိုဒယ်လ်တန်များ) ကို A နှင့် C ၏ ဘယ်ဘက်တွင် ပြထားသည်။ (D) သတ်မှတ်ထားသော အမိုင်နိုအက်ဆစ်အစားထိုး သယ်ဆောင်သည့် HCoV-229E nsp12-His6 ၏ မျိုးပြောင်းပုံစံသည် [α-32P]UTP တွင် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ ပစ္စည်းများနှင့် နည်းစနစ်များတွင်NMPylation တုံ့ပြန်မှုတွင် ထုတ်ပေးသော ရေဒီယိုဓာတ်တံဆိပ်တပ်ထားသော nsp9-His6 ကို phosphorylation ပုံရိပ် (D၊ ထိပ်) ဖြင့် ရှာဖွေတွေ့ရှိသည်။တောရိုင်းအမျိုးအစား (wt) ပရိုတင်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်သည့် နှိုင်းယှဥ်လုပ်ဆောင်မှုကို D တွင် ပြထားပြီး လွတ်လပ်သော စမ်းသပ်မှုသုံးခုမှ အောက်ခြေအား ပျမ်းမျှ (±SEM) အဖြစ် ယူသည်။ခရေပွင့်များသည် ထိန်းသိမ်းထားခြင်းမရှိသော အကြွင်းအကျန်များကို အစားထိုးမှုများကို ဖော်ပြသည်။(င) ရောဂါပိုးကူးစက်ပြီးနောက် ၂၄ နာရီအတွင်း ရရှိသော p1 ဆဲလ်များ၏ ယဉ်ကျေးမှု လွန်ကဲသော ဗိုင်းရပ်စ် titer ကို plaque assay ဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။အင်ဂျင်နီယာဆိုင်ရာ HCoV-229E mutant ၏ NiRAN ဒိုမိန်းရှိ codon အစားထိုးမှုများကို ညွှန်ပြသည် (ကျန်နံပါတ်များကို pp1ab တွင် ၎င်းတို့၏ ရာထူးအပေါ်အခြေခံသည်)။ပုံတူပွားခြင်း-ချို့တဲ့သော RdRp တက်ကြွသောဆိုက် mutant nsp12_DD4823/4AA ကို ထိန်းချုပ်မှုတစ်ခုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။
NiRAN ၏တက်ကြွသော site ကိုပိုမိုနက်ရှိုင်းစွာနားလည်သဘောပေါက်ရန်နှင့် nsp9-specific NMP transferase ၏လုပ်ဆောင်ချက်နှင့်ဆက်စပ်သောအကြွင်းအကျန်များကိုဆုံးဖြတ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် NiRAN AN၊ BN နှင့် CN motifs များတွင် ရှေးရိုးစွဲအကြွင်းအကျန်များကို အစားထိုးထားသော ဗီဇပြောင်းလဲခြင်းဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုပြုလုပ်ခဲ့သည် ( 16) ၎င်းသည် Ala (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S2) ဖြစ်သည်။ထို့အပြင် ရှေးရိုးစွဲ Arg-to-Lys သို့မဟုတ် Lys-to-Arg အစားထိုးမှုများ၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို ကိစ္စနှစ်ခုတွင် အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။(အနုတ်လက္ခဏာ) ထိန်းချုပ်မှုအနေဖြင့် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်များ၏ NiRAN ဒိုမိန်းတွင် သို့မဟုတ် လျော့နည်းထိန်းသိမ်းမှုမရှိသော အကြွင်းအကျန်များကို Ala ဖြင့် အစားထိုးထားသည်။ K4116A (motif preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (motif BN) နှင့် D4280A (CN) သည် nsp9 NMPylation ကို nsp12 မှတစ်ဆင့် သိသိသာသာ လျှော့ချပေးသည် သို့မဟုတ် ဖယ်ရှားပေးကာ ကွန်ဆာဗေးတစ် အစားထိုးမှုများ (R4178K), K4116R) သည် ၎င်းတို့၏ လှုပ်ရှားမှု၏ 60% နှင့် 80% ကို ဆက်လက်ထိန်းသိမ်းထားနိုင်သည်၊ ၎င်းသည် သက်ဆိုင်ရာဘက်မှ ကန့်သတ်ချက်များကို လျှော့ပေါ့ပေးထားကြောင်း ဖော်ပြသည်။ ကွင်းဆက်များသည် ရူပဓာတုဗေဒအရ ထိခိုက်လွယ်သည် (ပုံ 3D)။အခြားထိန်းသိမ်းထားသော အကြွင်းအကျန်များစွာကို E4145A၊ D4273A၊ F4281A နှင့် D4283A တို့ကို အစားထိုးခြင်းသည် အန္တရာယ်အလွန်နည်းပါးပြီး nsp9 UMPylation သည် အတန်အသင့်သာ လျှော့ချထားသည်။အခြား NTP များ (ပုံ 3D နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲ၊ Figure S3) ပါ၀င်သော nsp9 NMPylation တုံ့ပြန်မှုများတွင် အလားတူရလဒ်များကို ရရှိခဲ့သည်ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုရှိ coronaviruses မျိုးပွားမှုအပေါ် ဤ nsp12 အစားထိုးမှုများ၏ ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသောအကျိုးသက်ရောက်မှုကို စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ဤအဆုံးသတ်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ပြန်လည်ပေါင်းစည်းထားသော ကာကွယ်ဆေး ဗိုင်းရပ်စ် (23၊ 24) တွင် ဆဲလ် 5 -7 ဆဲလ်များကို ကူးယူဖော်ပြရန်အတွက် သင့်လျော်သော မျိုးဗီဇအင်ဂျင်နီယာဆိုင်ရာ ဖြည့်စွက် DNA (cDNA) ပုံစံများကို အသုံးပြုထားပါသည်။ဤဆဲလ်များမှထုတ်လုပ်သော ကူးစက်တတ်သောဗိုင်းရပ်စ်မျိုးပွားခြင်း၏ titration သည် HCoV-229E NiRAN mutants အများစုသည် မဖြစ်နိုင်ကြောင်းပြသခဲ့သည် (ပုံ 3E)။မဖြစ်နိုင်သောဗိုင်းရပ်စ်မျိုးပြောင်းအုပ်စုတွင် NMP Transferase လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဖယ်ရှားရန် သို့မဟုတ် သိသာထင်ရှားစွာ လျှော့ချရန် ပြသထားသည့် အခြားရွေးချယ်စရာများ ပါဝင်သည် % သီးသန့်ထားမလား။၎င်းတို့၏ အင်တီအောက်ဆီးဒင့် NMPylation လုပ်ဆောင်ချက်သည် နောက်ထပ်ကန့်သတ်ချက်များ ပါဝင်ကြောင်း အကြံပြုသည်။အလားတူပင်၊ NiRAN ၏ vitro NMPylation လှုပ်ရှားမှုတွင် အလယ်အလတ်လျော့ကျစေသော အခြားဗီဇပြောင်းလဲမှုနှစ်ခု (R4178K၊ F4281A) သည် တိုက်ရိုက်ဗိုင်းရပ်စ်များကို ထုတ်ပေးသော်လည်း၊ ဤဗိုင်းရပ်စ်များသည် မျိုးပွားခြင်းမှတစ်ဆင့် titer များကို သိသိသာသာ လျှော့ချပေးပါသည်။ပုံ 3D တွင်ပြသထားသည့် in vitro လုပ်ဆောင်ချက်ဒေတာနှင့် တသမတ်တည်းဖြစ်ပြီး၊ ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်နှင့်/သို့မဟုတ် အခြားအသိုက်အမြုံမဖြစ်သော အခြားအကြွင်းအကျန်လေးခုကို အစားထိုးခြင်း (K4113A၊ D4180A၊ D4197A၊ D4273A) (8၊ 16) သည် ရှင်သန်နိုင်သောဗိုင်းရပ်စ်များရှိသည့် အမျိုးအနွယ်များကို ထုတ်ပေးသော်လည်း၊ တောရိုင်း အမျိုးအစား ဗိုင်းရပ်စ် (ပုံ 3E) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အတန်အသင့် လျော့ကျသွားပါသည်။
NiRAN-mediated NMP transferase လုပ်ဆောင်ချက်သည် တက်ကြွသော RdRp ဒိုမိန်းပေါ်တွင်မူတည်ခြင်း ရှိ၊ မရှိ လေ့လာရန်အတွက်၊ RdRp motif C တွင် divalent metal ions (11) ၏ညှိနှိုင်းမှုတွင်ပါရှိသော ထိန်းသိမ်းထားသော Asp အကြွင်းအကျန် (11) ကို Ala ဖြင့် အစားထိုးလိုက်ပါသည်။ ရလဒ်အနေဖြင့် nsp12_DD4823/4AA သည် ပရိုတင်းဓာတ်ကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။ ၎င်း၏ nsp9 NMPylation လုပ်ဆောင်ချက်၊ nsp12-mediated in vitro nsp9 NMPylation လုပ်ဆောင်ချက်သည် polymerase လုပ်ဆောင်ချက်မလိုအပ်ပါ (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S4) ကို ညွှန်ပြသည်။
nsp12 အတွက် nsp9-specific NMP transferase လုပ်ဆောင်ချက်ကို တည်ထောင်ပြီးနောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် NMP-nsp9 adduct ကို အစုလိုက်အပြုံလိုက် spectrometry (MS) ဖြင့် သတ်မှတ်ရန် ကြိုးစားခဲ့သည်။recombinant HCoV-229E nsp9 ၏ ပြီးပြည့်စုံသော ပရိုတင်းအစုလိုက်အပြုံလိုက် spectrum သည် 12,045 Da (ပုံ 4A) တွင် အထွတ်အထိပ်ကို ပြသခဲ့သည်။nsp12 ၏ထပ်တိုးမှုသည် nsp9 ၏အရည်အသွေးကိုမပြောင်းလဲဘဲ၊ nsp12 နှင့် nsp9 သည်အသုံးပြုထားသောအခြေအနေများအောက်တွင်တည်ငြိမ်သောရှုပ်ထွေးမှုတစ်ခုမဖွဲ့နိုင်သည်ကိုဖော်ပြသည် (ပုံ 4A)။UTP နှင့် GTP ၏ရှေ့မှောက်တွင်၊ nsp9 နှင့် nsp12 ပါရှိသောတုံ့ပြန်မှု၏ထုထည်တိုင်းတာမှုတွင် UTP ၏ပရိုတင်းထုထည်သည် 306 Da ရွေ့သွားကြောင်းပြသခဲ့ပြီး GTP ၏ပရိုတင်းထုထည်သည် 345 Da သို့ပြောင်းသွားကာ nsp9 မော်လီကျူးတစ်ခုစီသည် UMP သို့မဟုတ် GMP နှင့် ချိတ်ဆက်ထားကြောင်းဖော်ပြသည်။ (၄) C နှင့် D) ပုံ။NiRAN-mediated nsp9 NMPylation အတွက် လိုအပ်သော စွမ်းအင်သည် NTP hydrolysis နှင့် pyrophosphate ထုတ်လွှတ်မှုမှ လာသည်ဟု ခန့်မှန်းရသည်။ဤတုံ့ပြန်မှုတွင် nsp12 (အင်ဇိုင်း) ထက် အံသွား 10 ဆပိုလျှံခြင်းကို အသုံးပြုခဲ့သော်လည်း၊ nsp9 ၏ ပြီးပြည့်စုံသော NMPylation နီးပါးကို တွေ့ရှိရပြီး nsp12 နှင့် nsp9 အကြား အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုသည် တိုတောင်းကြောင်း၊ nsp12 သည် NMPylate ပိုမို nsp9 လုပ်နိုင်သည် vitro မော်လီကျူး။
nsp12 နှင့် UTP သို့မဟုတ် GTP ၏ရှေ့မှောက်တွင် nsp9 ၏တစ်ခုတည်း NMPylation ။ပြထားသည်မှာ HCoV-229E nsp9 (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ Table S1) (AD) ၏ ဖယ်ထုတ်ထားသော ပြီးပြည့်စုံသော ပရိုတင်းအစုလိုက်အပြုံလိုက် ရောင်စဉ်ဖြစ်သည်။(A) nsp9 တစ်ခုတည်း, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 ၏ရှေ့မှောက်တွင် GTP ။
nsp12 မှ UMPylated nsp9 အကြွင်းအကျန်များကို ဆုံးဖြတ်ရန်၊ nsp9-UMP အား trypsin ဖြင့် ပိုင်းခြားထားသည်။ရရှိလာသော peptides အား nano-high performance liquid chromatography (HPLC) ဖြင့် ပိုင်းခြားပြီး tandem mass spectrometry (MS/MS) online ဖြင့် ပိုင်းခြားထားပါသည်။Byonic ဆော့ဖ်ဝဲလ်ပက်ကေ့ချ် (ပရိုတင်းမက်ထရစ်များ) ကိုအသုံးပြု၍ ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် N-terminal အမိုင်နိုအက်ဆစ်၏ UMPylation ကိုပြသခဲ့သည်။ဤသည်ကို ကိုယ်တိုင် အတည်ပြုသည်။ရှေ့ပြေး peptide [UMP]NNEIMPGK (SI appendix, Figure S5A) ၏ tandem mass spectrum သည် 421 m/z တွင် အပိုင်းအစတစ်ခုကို ထုတ်ပြပြီး UMP သည် residue 1 ၏ nsp9 နှင့် ချိတ်ဆက်ထားကြောင်း ဖော်ပြသည်။
nsp9 ၏ N-terminus တွင်၊ Asn ကို Orthocoronavirinae (SI appendix, Figure S6) ၏အင်္ဂါများကြားတွင် ထိန်းသိမ်းထားသည်။N-terminal ပင်မအမင်းနိုက်ထရိုဂျင်သည် UMP အတွက် ဖြစ်နိုင်ခြေအရှိဆုံးလက်ခံသူဖြစ်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ယုံကြည်သော်လည်း၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် N-terminal တွင် NMP binding ၏နောက်ထပ်အထောက်အထားများရယူရန် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ဤအကြောင်းကြောင့် HPLC မှသန့်စင်သော NMPylated နှင့် NMPylated မဟုတ်သော N-terminal peptide nsp9 ကို acetone နှင့် sodium cyanoborohydride ၏ရှေ့မှောက်တွင် ဆင်းသက်လာသည်။ဤအခြေအနေများအောက်တွင်၊ အခမဲ့ပင်မအမင်းများကိုသာ propyl (25) ဖြင့် ပြုပြင်နိုင်သည်။N-terminal nsp9 မှရရှိသော peptide တွင် NNEIMPGK တွင် မူလအamines နှစ်ခုပါဝင်ပြီး၊ တစ်ခုသည် Asn ၏ N-terminus တွင် နှင့် C-terminus ရှိ Lys ၏ ဘေးထွက်ကွင်းဆက်တွင် အခြားတစ်ခုပါဝင်သည်။ထို့ကြောင့် propyl အုပ်စုများကို နှစ်ဖက်စလုံးတွင် မိတ်ဆက်နိုင်သည်။NMPylated peptides မဟုတ်သော ထုတ်ယူထားသော အိုင်းယွန်း ခရိုတိုဂရမ်များကို SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S5B တွင် ပြထားသည်။မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ N-terminal နှင့် C-terminal (mono)propylated (SI appendix, Figure S5B, upper lane) နှင့် dipropylated peptides (SI appendix, Figure S5B, lower lane) ကို ဖော်ထုတ်နိုင်ပါသည်။ဤပုံစံသည် nsp9 ၏ NMPylated N-terminal peptide ကိုအသုံးပြုခြင်းဖြင့် ပြောင်းလဲပါသည်။ဤကိစ္စတွင်၊ C-terminal propylated peptides များကိုသာ ဖော်ထုတ်နိုင်သော်လည်း N-terminal propylated peptides နှင့် dipropylated peptides များကို မဖော်ထုတ်နိုင်ပါ (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S5C)၊ UMP သည် N-terminal primary amine သို့ လွှဲပြောင်းထားကြောင်း ညွှန်ပြနေပါသည်။ အပြောင်းအလဲများ ပြုလုပ်နေသည့်အဖွဲ့။
ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ပစ်မှတ်-သတ်သတ်မှတ်မှတ် ကန့်သတ်ချက်များကို သတ်မှတ်ရန်အတွက် N-terminus ၏ N-terminus တွင် ထိန်းသိမ်းထားသော အကြွင်းအကျန်များကို (Ala သို့မဟုတ် Ser) ဖြင့် အစားထိုးပါ။ကျွန်ုပ်တို့၏ MS ဒေတာပေါ်တွင် NiRAN သည် nsp9 ၏ N-terminal အကြွင်းအကျန်များ၏ ပင်မ amine နှင့် nsp9-NMP adduct ကိုဖွဲ့စည်းကြောင်းပြသခြင်းအပေါ် အခြေခံ၍ ကျွန်ုပ်တို့သည် nsp9 NMPylation မှ nsp9 N-terminal ကိုထုတ်လွှတ်ရန်အတွက် ဗိုင်းရပ်စ် master protease (Mpro, nsp5) လိုအပ်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ယူဆခဲ့သည် ၎င်း၏ polyprotein ရှေ့ပြေးနိမိတ်။ဤယူဆချက်အား စမ်းသပ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် E. coli တွင် nsp9 ပါရှိသော nsp7-11 ရှေ့ပြေးပရိုတင်း nsp7-11 ကိုထုတ်လုပ်ပြီး [α-32P] UTP (ပစ္စည်းများနှင့် နည်းလမ်းများ) တွင် စံ NMPylation စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ပုံ 5A (လမ်းကြော 3 တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း) မဖြတ်တောက်ထားသော nsp7-11 ရှေ့ပြေးဆာသည် nsp12 ဖြင့် ရေဒီယိုတံဆိပ်တပ်ထားခြင်းမရှိပါ။ဆန့်ကျင်ဘက်အနေနှင့်၊ အကယ်၍ nsp7-11 ကို ရှေ့ပြေးနမိတ်မှ nsp9 (နှင့် အခြား nsps) မှ ထုတ်လွှတ်ရန် recombinant nsp5 ဖြင့် ခွာထားပါက၊ nsp9 နှင့် ရွှေ့ပြောင်းသွားသည့် ရေဒီယိုဓာတ်ပါသော ပရိုတင်းကို တွေ့ရှိပြီး NiRAN နှင့် N- covalent nsp9-NMP adducts များကို ရွေးချယ်ဖွဲ့စည်းကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့၏ ကောက်ချက်အား အတည်ပြုသည်။ .N-terminal Asn (pp1a/pp1ab တွင် အနေအထား 3825)။N-terminus တွင် နောက်ထပ် အကြွင်းအကျန် တစ်ခု သို့မဟုတ် နှစ်ခုပါရှိသော nsp9 တည်ဆောက်မှုကို အသုံးပြု၍ စမ်းသပ်မှုများမှလည်း ဤကောက်ချက်ကို ထောက်ခံပါသည်။ဖြစ်ရပ်နှစ်ခုစလုံးတွင် nsp9 ၏ NiRAN-ဖျန်ဖြေပေးသော UMPylation ကို ဖျက်သိမ်းလိုက်သည် (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S7)။ထို့နောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် nsp9 ၏ N-terminal ရှိ 3825-NNEIMPK-3832 peptide အစီအစဉ်မှ ဖျက်ထားသော Asn အကြွင်းအကျန်တစ်ခု သို့မဟုတ် နှစ်ခုပါသည့် ပရိုတင်းတစ်မျိုးကို ထုတ်လုပ်သည်။ဖြစ်ရပ်နှစ်ခုစလုံးတွင်၊ nsp9 UMPylation သည် လုံးဝပိတ်ဆို့ထားသည် (ပုံ 5B)၊ အမှန်တကယ် nsp9 N-terminus သည် NMP receptor တစ်ခုအဖြစ် လုပ်ဆောင်ကြောင်း ထပ်လောင်းအထောက်အထားများပေးသည်။
nsp9 ၏ proteolytic လုပ်ဆောင်ခြင်းနှင့် nsp12-mediated UMPylation တွင် N-terminal အကြွင်းအကျန်များ၏အခန်းကဏ္ဍ။(က) nsp9 UMPylation သည် အခမဲ့ nsp9 N-terminal လိုအပ်သည်။Nsp7-11-His6 ကို NMPylation ထောက်လှမ်းခြင်းကြားခံတွင် 30 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် UTP ရှိနေခြင်း သို့မဟုတ် ပြန်လည်ပေါင်းစည်းထားသော Mpro (nsp5-His6) မရှိခြင်း သို့မဟုတ် ကြိုတင်ပေါက်ဖွားသည်။3 နာရီကြာပြီးနောက်၊ Materials and Methods တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း nsp12-His6 ကိုထည့်ခြင်းဖြင့် NMPylation assay ကိုစတင်ပါ။nsp5-His6 (လမ်းကြော 1) နှင့် nsp9-His6 (လမ်းကြော 2) ပါဝင်သော တုံ့ပြန်မှုကို ထိန်းချုပ်မှုတစ်ခုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။10 မိနစ်အကြာတွင်၊ တုံ့ပြန်မှုကိုရပ်စဲပြီးတုံ့ပြန်မှုအရောအနှောကို SDS-PAGE ဖြင့်ခွဲခြားထားသည်။ပရိုတင်းကို Coomassie Brilliant Blue (A၊ အပေါ်) ဖြင့် စွန်းထင်းခဲ့သည်။Nsp7-11-His6 ရှေ့ပြေးနိမိတ်နှင့် nsp5-His6 ဖျန်ဖြေခြင်းမှ ထွက်ပေါ်လာသော စီမံထားသော ထုတ်ကုန်ကို ညာဘက်တွင် ပြထားသည်။ဤဂျယ်တွင် nsp7 နှင့် nsp11-His6 ကို ရှာမတွေ့နိုင်ပါ (၎င်းတို့၏သေးငယ်သောအရွယ်အစားကြောင့်) သတိပြုပါ၊ တုံ့ပြန်မှုကို nsp5-His6 ဖြင့်ဖြည့်စွက်ထားသည် (လမ်းကြော 1 နှင့် 4၊ nsp5-His6 ၏အနေအထားကို အစိုင်အခဲအဝိုင်းဖြင့်ညွှန်ပြသည်) သို့မဟုတ် nsp9-His6 (လမ်းကြော 2) တွင် MBP ပေါင်းစပ်ပရိုတိန်းများ (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ဇယား S1) အဖြစ်ဖော်ပြသောကြောင့် ကျန်ရှိသောအညစ်အကြေးများအဖြစ် MBP ပမာဏအနည်းငယ်ပါရှိသည်။(ခ) Nsp9-His6 မျိုးကွဲသည် N-terminal Asn အကြွင်းအကျန်တစ်ခု သို့မဟုတ် နှစ်ခု (pp1a/pp1ab တွင် အနေအထားအရ အကြွင်းအကျန်နံပါတ်များ) ချို့တဲ့ပြီး nsp12-His6 နှင့် [α-32P] UTP ဖြင့် သန့်စင်ပြီး ပေါက်ဖွားသည်။B၊ Coomassie ဖြင့် စွန်းထင်းနေသော SDS-PAGE ကို အပေါ်ဆုံးတွင် ပြသသည်၊ B၊ သက်ဆိုင်ရာ ဓာတ်မှန်ရိုက်ချက်ကို အောက်ခြေတွင် ပြသထားသည်။မော်လီကျူးအလေးချိန် အမှတ်အသား (ကီလိုဒယ်လ်တန်) ၏ အနေအထားကို ဘယ်ဘက်တွင် ပြထားသည်။(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminal ထိန်းသိမ်းထားသော အကြွင်းအကျန်များကို Ala သို့မဟုတ် Ser ဖြင့် အစားထိုးခဲ့ပြီး တူညီသောပမာဏကို nsp12-His6 ကြားခံ UMPylation တုံ့ပြန်မှုတွင် အသုံးပြုခဲ့သည်။တုံ့ပြန်မှုထုတ်ကုန်များကို SDS-PAGE ဖြင့် ပိုင်းခြားထားပြီး Coomassie Brilliant Blue (C၊ ထိပ်) ဖြင့် စွန်းထင်းနေပြီး ရေဒီယိုတံဆိပ်တပ်ထားသည့် nsp9-His6 ကို phosphorescence ပုံရိပ်ဖော်ခြင်း (C၊ အလယ်) ဖြင့် တွေ့ရှိခဲ့သည်။အကိုးအကားအဖြစ် တောရိုင်းအမျိုးအစား (wt) ပရိုတင်းကို အသုံးပြု၍ ဆွေမျိုး NMPylation လုပ်ဆောင်ချက် (ပျမ်းမျှ ± SEM) ကို သီးခြားလွတ်လပ်သော စမ်းသပ်မှု သုံးခုမှ တွက်ချက်ခဲ့သည်။(ဃ) HCoV-229E တောရိုင်းအမျိုးအစား Huh-7 ဆဲလ်များ ကူးစက်ခံထားရသည့် Huh-7 ဆဲလ်များ၏ p1 ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှု လွန်ကဲသော ဗိုင်းရပ်စ် titers များနှင့် nsp9 တွင် သတ်မှတ်ထားသော အမိုင်နိုအက်ဆစ်အစားထိုးမှုများ သယ်ဆောင်သည့် ဗီရိုများကို plaque assay ဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ပုံတူပွားခြင်း-ချို့တဲ့သော RdRp motif C နှစ်ထပ်ပြောင်းလဲမှု DD4823/4AA ကို အနုတ်လက္ခဏာထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။
nsp9 ၏ N-terminus (အထူးသဖြင့် ရာထူး 1၊ 2၊ 3၊ နှင့် 6) သည် Orthocoronavirinae subfamily (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S6) ၏ အဖွဲ့ဝင်များကြားတွင် အလွန်ထိန်းသိမ်းထားသည်။nsp12-mediated nsp9 NMPylation တွင် ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော ဤအကြွင်းအကျန်များကို လေ့လာရန်အတွက် nsp9 ၏ N-terminus ရှိ Asn အကြွင်းအကျန်နှစ်ခုကို Ala သို့မဟုတ် Ser (တစ်ဦးတည်း သို့မဟုတ် ပေါင်းစပ်မှု) ဖြင့် အစားထိုးခဲ့သည်။ရိုင်းအမျိုးအစား nsp9 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက N3825 ကို Ala သို့မဟုတ် Ser ဖြင့် အစားထိုးခြင်းဖြင့် nsp12-mediated UMPylation (ပုံ 5C) တွင် နှစ်ဆကျော် လျော့နည်းစေပါသည်။NMPylation သည် N-terminal residue ၏ဘေးထွက်ကွင်းဆက်အစား NMPylation တွင်ဖြစ်ပေါ်သည်ဟူသောကျွန်ုပ်တို့၏ကောက်ချက်နှင့်အညီ၊ N3825A နှင့် N3825S တို့ကို အစားထိုးခြင်းဖြင့် သိသာထင်ရှားသောကျန်နေသော NMPylation ကိုကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ပါသည်။စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ ဒုတိယ Asn ကို Ala သို့မဟုတ် Ser ဖြင့် အစားထိုးပါက၊ nsp9 UMPylation သည် ပိုမိုပြင်းထန်စွာ (၁၀ ဆကျော်) လျော့ကျသွားသော်လည်း ရာထူး 3၊ 4 နှင့် 6 တွင် Ala အစားထိုးမှုသည် nsp9 UMPylation တွင် အလယ်အလတ်အကျိုးသက်ရောက်မှုသာရှိသည် (ပုံ 2) )5C)။ATP၊ CTP သို့မဟုတ် GTP (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S8) ကို အသုံးပြု၍ အလားတူရလဒ်များကို ရရှိခဲ့သည်။စုပေါင်းအားဖြင့်၊ ဤဒေတာများသည် nsp9 NMPylation တွင် N2826 (ရာထူး 2 တွင် nsp9) ၏ အဓိကအခန်းကဏ္ဍကို ဖော်ပြသည်။
nsp9 နှင့် NMPylation ၏ N-terminus နှင့် NMPylation အကြား လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ ဆက်နွယ်မှုဆိုင်ရာ နောက်ထပ်အထောက်အထားများ ရယူနိုင်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် Coronavirus မိသားစု၏ nsp9 အစီအစဥ်၏ မျိုးစုံသော sequence alignment (MSA) ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည် (ကျန်ကြွင်းသော 104 နှင့် 113 ကြား) (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S6)။စုစုပေါင်း၊ မတူညီသောနို့တိုက်သတ္တဝါများ၊ ငှက်များနှင့်တွားသွားသတ္တဝါများကိုကူးစက်သော Orthocoronavirinae မျိုးစိတ် 5 မျိုး၏ (လူသိများပြီး putative) မျိုးစိတ် 47 တွင်စုစုပေါင်း 8 အကြွင်းအကျန်များကိုမတူညီကြောင်းတွေ့ရှိခဲ့သည်။ယခင်ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာလေ့လာမှုများ (26 ??28) မှဆုံးဖြတ်ထားသည့်အတိုင်း nsp9 ၏ဒုတိယဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာဒြပ်စင်များကြားတွင် ဖျက်ခြင်းနှင့်ထည့်သွင်းခြင်းအပါအဝင် အကျယ်ပြန့်ဆုံးပြောင်းလဲမှုများကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။မပြောင်းလဲသော အကြွင်းအကျန်ငါးခုကို nsp9 ၏ C-terminal အစိတ်အပိုင်း၏ β ကြိုးနှင့် α helix တွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်။မပြောင်းလဲသော အကြွင်းသုံးခုသည် nsp9 ၏ N terminus ၏ NNE motif ဖြစ်သည်။ဤပုံစံ၏ဒုတိယ Asn သည် အဝေးမှဆက်စပ်နေသောဖားကိုရိုနာဗိုင်းရပ်၏ hypothetical nsp9 မှမျှဝေထားသည့်တစ်ခုတည်းသောမူကွဲအကြွင်းအကျန်ဖြစ်ပြီး Alphaletovirus ၏မျိုးစိတ်ခွဲရှိ Microhyla letovirus 1 မျိုးစိတ်များကိုကိုယ်စားပြုကြောင်းထင်ရှားပါသည်။nsp9 ဆင့်ပွားဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာဒြပ်စင်များတွင် အကြွင်းအကျန်များကို ထိန်းသိမ်းခြင်းသည် ခေါက်ခြင်း သို့မဟုတ် သိထားသော RNA ပေါင်းစပ်ဂုဏ်သတ္တိများကို ထိန်းသိမ်းထားရန် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ထည့်သွင်းစဉ်းစားမှုများဖြင့် ကျိုးကြောင်းဆီလျော်စွာ သုံးသပ်နိုင်သည်။သို့သော်၊ ဤကျိုးကြောင်းဆင်ခြင်မှုသည် NNE ၏ထိန်းသိမ်းမှုနှင့်သက်ဆိုင်ပုံမပေါ်ဘဲ၊ ဤလေ့လာမှုမတိုင်မီ၊ tripeptide အစီအစဥ်၏ကွဲပြားမှုကိုကန့်သတ်သည့်ကန့်သတ်ချက်များ၏သဘောသဘာဝသည်လုံးဝဖုံးကွယ်ထားသည်။
nsp9-NMPylation နှင့် NNE ထိန်းသိမ်းရေးအတွက် အရေးကြီးပုံကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် nsp9 NMPylation သည် vitro တွင် အန္တရာယ်ရှိကြောင်း ညွှန်ပြသော nsp9 N-terminal အကြွင်းအကျန်များကို တစ်ခုတည်း သို့မဟုတ် နှစ်ဆအစားထိုးသည့် HCoV-229E mutants ကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ကျွန်ုပ်တို့မစတင်မီ၊ ဤအစားထိုးမှုများ (nsp8|9 ခွဲထွက်သည့်နေရာအနီး) သည် C-terminal pp1a ဒေသ၏ proteolytic လုပ်ဆောင်ခြင်းကို အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိမရှိ မေးခွန်းကို ဖြေရန် ကြိုးစားပါသည်။nsp9 ၏ N-terminus တွင် သက်ဆိုင်ရာ အစားထိုးမှုများ ပါဝင်သော nsp7-11 ပိုလီပရိုတင်း တည်ဆောက်မှုအစုအဝေးကို E. coli ဖြင့် ထုတ်လုပ်ပြီး ပြန်လည်ပေါင်းစပ် Mpro ဖြင့် ပိုင်းဖြတ်ထားသည်။ဆိုဒ်လေးခု၏ proteolytic ကွဲအက်မှု (nsp9 ဘေးကင်းသောဆိုဒ် အပါအဝင်) သည် မိတ်ဆက်ထားသော အစားထိုးမှုများ (SI appendix၊ Figure S9) မှ သိသိသာသာ ထိခိုက်မှုမရှိပါ။ ဝဘ်ဆိုဒ်။
Huh-7 ဆဲလ်များသည် nsp9 N terminus တွင် ထိန်းသိမ်းထားသော NNE tripeptides (N3825၊ N3826 နှင့် E3827) တွင် Ala သို့မဟုတ် Ser အစားထိုးမှုများကို ကုဒ်သွင်းခြင်းဖြင့် ဂျီနိုမအရှည် HCoV-229E RNA ဖြင့် ကူးစက်သွားပါသည်။N-terminal Asn (N2835A သို့မဟုတ် N2835S) ၏ Ser သို့မဟုတ် Ala ကို အစားထိုးခြင်းဖြင့် ဗိုင်းရပ်စ်ကို ကျွန်ုပ်တို့ ကယ်ဆယ်နိုင်ခဲ့သော်လည်း NNE အမျိုးအစား (N3826A၊ N3826S၊ NN3825/6AA၊ NN3825/6SS) ၊ E3827A) (ပုံ 5D)။
ဤရလဒ်များက တစ်သျှူးယဉ်ကျေးမှုရှိ coronaviruses ၏ပုံတူကူးခြင်းကိုကန့်သတ်ထားသည် (တူညီသောသို့မဟုတ်အလားတူ)၊ ခန္ဓာကိုယ်အတွင်းရှိ nsp9 NMPylation sites များ၏သဘာဝပြောင်းလဲမှုကိုကန့်သတ်ခြင်းနှင့် coronaviruses ၏ဘဝသံသရာတွင်ဤတုံ့ပြန်မှု၏အဓိကအခန်းကဏ္ဍကိုပံ့ပိုးပေးကြောင်းဤရလဒ်များကဖော်ပြသည်။
နောက်ဆုံးစမ်းသပ်မှုအစုတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် SARS-CoV-2 nsp12 နှင့် nsp9 တံဆိပ်တပ်ထားသော C-terminal His6 နှင့် E. coli တွင် nsp12 ပုံစံနှစ်မျိုးကို ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။NiRAN နှင့် RdRp ဒိုမိန်းများတွင် တက်ကြွသောဆိုက်အကြွင်းအကျန်များကို အသီးသီးအစား Ala ကိုသုံးပါ (ပုံ 6A နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ဇယား S2)။SARS-CoV-2 nsp12 တွင် K4465 သည် NiRAN လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် HCoV-229E ပုံတူကူးပုံ (ပုံ 3D နှင့် E) အတွက် လိုအပ်ကြောင်း သက်သေပြခဲ့သည့် HCoV-229E (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S2) တွင် K4135 နှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ဤကျန်ကြွင်းမှုသည် NiRAN self-UMPylation/self-GMPylation (16) အတွက် လိုအပ်သည်ဟု ယခင်ကပြသခဲ့သည့် သွေးလွှတ်ကြောဗိုင်းရပ်စ် EAV nsp9 K94 အကြွင်းအကျန်နှင့်လည်း သက်ဆိုင်ပါသည်။ပုံ 6B တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း၊ SARS-CoV-2 nsp12 တွင် nsp9 ကိုအလွှာအဖြစ်အသုံးပြုထားသော UMP Transferase လုပ်ဆောင်ချက်ရှိပြီး nsp12_K4465A တက်ကြွသောဆိုက်မူတန်သည် အသက်မဝင်ပါ။RdRp motif C ၏ SDD ဝိသေသအစီအစဥ်တွင် နှစ်ဆအစားထိုးခြင်းသည် UMP transferase လုပ်ဆောင်ချက် (ပုံ 6B) ကို ထိခိုက်ခြင်းမရှိပါ၊ RdRp လုပ်ဆောင်ချက်သည် nsp9 UMPylation တွင် တိုက်ရိုက်သက်ရောက်မှုမရှိဟု ညွှန်ပြပါသည်။အလားတူဒေတာကို CTP၊ GTP နှင့် ATP (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S10) ဖြင့် ရယူခဲ့သည်။အချုပ်အားဖြင့်၊ ဤအချက်အလက်များသည် NiRAN-ဖျန်ဖြေပေးထားသော nsp9 NMPylation တွင် orthocoronavirus မျိုးကွဲ၏ မတူညီသောမျိုးစိတ်များကိုကိုယ်စားပြုသည့် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်များတွင် ရှေးရိုးဆန်သောလုပ်ဆောင်မှုတစ်ခုပါရှိသည်။
nsp9 ၏ SARS-CoV-2 nsp12-mediated NMPylation(က) NMPylation စမ်းသပ်မှုတွင် အသုံးပြုသည့် ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ပရိုတင်းကို ပြသသည့် Coomassie မှ SDS-polyacrylamide ဂျယ်။ထိန်းချုပ်မှုအနေဖြင့် NiRAN ဒိုမိန်း (K4465A) နှင့် SARS-CoV-2 nsp12 ၏ RdRp ဒိုမိန်း (DD5152/3AA) တွင် တက်ကြွသောဆိုဒ်အစားထိုးမှုဖြင့် မျိုးပြောင်းပရိုတင်းကို အသုံးပြုခဲ့သည်။အကြွင်းနံပါတ်သတ်မှတ်မှုသည် pp1ab တွင် အနေအထားအပေါ်အခြေခံသည်။(ခ) nsp12-His6 (ရိုင်းအမျိုးအစား [wt] နှင့် mutant) ၏ အလွှာအဖြစ် nsp9-His6 နှင့် [α-32P]UTP ကို အသုံးပြု၍ UMPylation ၏ Autoradiograph ထောက်လှမ်းခြင်း။တံဆိပ်တပ်ထားသော ပရိုတင်း၏ မော်လီကျူးထုထည် (ကီလိုဒယ်လ်တန်) ကို ဘယ်ဘက်တွင် ပြထားသည်။
NiRAN ဒိုမိန်းများကို ယေဘူယျအားဖြင့် Nidovirales (16) တွင် ထိန်းသိမ်းထားပြီး Nidovirus ပွားမှုအတွက် မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော အင်ဇိုင်းတုံ့ပြန်မှုများကို ဓာတ်ကူပေးကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်၏ NiRAN ဒိုမိန်းသည် NMP (NTP မှထုတ်လုပ်ထားသော)၊ ဗိုင်းရပ်စ်ပွားခြင်းတွင်ပါဝင်သော လျှို့ဝှက်ဆန်းကြယ်သော RNA binding ပရိုတင်း (26?? 29) သို့ NMP ကို ကူးပြောင်းကြောင်း သက်သေပြနိုင်ခဲ့ပြီး၊ coronavirus RTC ၏မိတ်ဖက်။
NiRAN ဒိုမိန်းသည် monophyletic တွင် မိသားစုအားလုံးတွင် ထိန်းသိမ်းထားသည့် အလွန်သေးငယ်သော အကြွင်းအကျန်များပါရှိသော အတွဲသုံးဆင့်ကို မျှဝေထားသော်လည်း အလွန်ကွဲပြားသော Nidovirales အစီအစဉ် (8၊ 16)။မကြာသေးမီက လေ့လာမှုများအရ ၎င်းတို့သည် မူလက SelO မိသားစု (17၊ 19၊ 22၊ 30၊ 31) ဟုခေါ်သော ပရိုတင်း kinase ကဲ့သို့သော ပရိုတိန်းမျိုးကွဲများနှင့် ဆက်စပ်နေကြောင်း ပြသခဲ့သည်။SelO နှင့်ဆက်စပ်သောပရိုတင်းများတွင် kinase ခေါက်များပါသော်လည်း classical kinases (22၊ 32) တွင် ထိန်းသိမ်းထားသော တက်ကြွသောနေရာအကြွင်းအကျန်များစွာ ကင်းမဲ့သည်။ATP မော်လီကျူးများ၏ ပြောင်းပြန် တိမ်းညွှတ်မှုကို အခြေခံ၍ တက်ကြွသော ဆိုက်နှင့် တိကျသော အပြန်အလှန် တုံ့ပြန်မှုများဖြင့် တည်ငြိမ်စေခြင်းအပေါ် အခြေခံ၍ SelO သည် မှန်းဆပြီး AMP (ဖော့စဖိတ်အစား) ပရိုတင်းအလွှာ (22) သို့ လွှဲပြောင်းရန် အတည်ပြုခဲ့ပြီး၊ အခြား SelO ကဲ့သို့သော ဘက်တီးရီးယား ပရိုတင်း YdiU ပါရှိသည်။ Tyr နှင့် UMP ၏ covalent တွယ်တာမှုကို မကြာသေးမီက ပြသခဲ့ပြီး မတူညီသော ပရိုတင်းအလွှာ (၃၃) ခု၏ အကြွင်းအကျန်များ။
ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် NiRAN ဒိုမိန်း၏ putative တက်ကြွသောဆိုက်အကြွင်းအကျန်များကို အတည်ပြုပြီး ချဲ့ထွင်နိုင်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်စ် nsp12 (ပုံ 3D နှင့် E နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S3 နှင့် ဇယား) S1â တွင် ဇီဝဓာတုနှင့် ပြောင်းပြန်မျိုးရိုးဗီဇနည်းလမ်းများကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ S4)။HCoV-229E K4135၊ R4178 နှင့် D4280 တို့ကို Ala ဖြင့် အစားထိုးခြင်းသည် ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုရှိ NMP Transferase လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် ဗိုင်းရပ်စ်ပွားခြင်းကို ဖယ်ရှားပေးသည် (ပုံ 3D နှင့် E နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲများ၊ ပုံ S3) တွင် ၎င်းတို့၏ ပါဝင်မှုကို ပံ့ပိုးပေးသည့် NTP γ-phosphate (K4135၊ R4178) နှင့် တက်ကြွသောဆိုဒ်သတ္တုအိုင်းယွန်း (D4280) ၏ညှိနှိုင်းမှု။K4135 (17) အနေအထားကို တည်ငြိမ်စေရန် ခန့်မှန်းထားသည့် ငှက်သိုက်ဗိုင်းရပ်စ်၏ အကွာအဝေးရှိ ထိန်းသိမ်းထားသော Glu ၏ E4145A အစားထိုးသည် ဗိုင်းရပ်စ်ပွားခြင်းကို ဖယ်ရှားပစ်ရန် ပြသထားသော်လည်း အံ့သြစရာကောင်းသည်မှာ လုပ်ဆောင်ချက်ကို in vitro NMPylation စစ်ဆေးမှုတွင် ဆက်လက်ထားရှိခဲ့သည် (ပုံ 3D နှင့် E နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S3 နှင့် Tables S1–S4)။Salmonella typhimurium (E130A) (33) ၏ YdiU homolog တွင် သက်ဆိုင်ရာ အစားထိုးမှုကို မိတ်ဆက်သောအခါ အလားတူ သတိပြုမိပါသည်။စုစည်းထားသော၊ ဤဒေတာများသည် ဓာတ်ပစ္စည်းများလုပ်ဆောင်ခြင်းထက် ဤထိန်းသိမ်းထားသောကျန်အကြွင်းအကျန်များ၏ စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းများကို ပံ့ပိုးပေးပါသည်။
HCoV-229E NiRAN ဒိုမိန်း (8) ရှိ nestovirus အကွာအဝေးအတွင်း ထိန်းသိမ်းထားသော Phe အကြွင်းအကျန် (F4281A) ကို အစားထိုးခြင်းသည် NMPylation လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဗီတိုအတွင်း ကျဆင်းစေပြီး ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုတွင် ဗိုင်းရပ်စ်မျိုးပွားမှု သိသိသာသာ ကျဆင်းသွားသည် (ပုံ 3D၊ E နှင့် SI) နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S3)။ဒေတာသည် ယခင်ကပြသထားသည့် တူညီသော DFG motif Phe အကြွင်းအကျန်ကဲ့သို့ ဤကျန်ကြွင်း၏ အရေးကြီးသော စည်းမျဉ်းစည်းကမ်းလုပ်ဆောင်ချက်နှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ရှေးရိုးပရိုတင်း kinases တွင် ၎င်းသည် Mg2+ binding loop ၏ အစိတ်အပိုင်းဖြစ်ပြီး ကျောရိုးကို စုစည်းရန်နှင့် ထိန်းညှိရန် ကူညီပေးသည်။??ထိရောက်သော ဓာတ်ပစ္စည်းများ လှုပ်ရှားမှုအတွက် လိုအပ်သည် (32၊ 34)။K4116 အကြွင်းအကျန်များအတွက် Ala နှင့် Arg ကို အစားထိုးခြင်း (preAN motif တွင်) အသီးသီး၊ ဗိုင်းရပ်စ်ပွားခြင်းကို ဖယ်ရှားပြီး မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ မိတ်ဆက်ထားသော အမိုင်နိုအက်ဆစ်ဘေးထွက်ကွင်းဆက်ပေါ်မူတည်၍ NMP transferase လုပ်ဆောင်ချက်အပေါ် ကွဲပြားသောအကျိုးသက်ရောက်မှုများရှိသည် (ပုံ 3D နှင့် E နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲများ ပုံ S3)။လုပ်ဆောင်နိုင်သောဒေတာသည် ဤအကြွင်းအကျန်သည် ATP ဖော့စဖိတ် (17) နှင့် အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း ညွှန်ပြသော ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ အချက်အလက်များနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။အခြားသော ဗိုင်းရပ်စ်မျိုးစုများ၏ NiRAN ဒိုမိန်းတွင်၊ HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 ၏ အနေအထားကို Lys၊ Arg သို့မဟုတ် His (8) မှ သိမ်းပိုက်ထားသည်၊ ဤအကြွင်းအကျန်များ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ ကန့်သတ်ချက်များကို ဖြေလျှော့လိုက်ကြောင်း ညွှန်ပြပါသည်။D4188A နှင့် D4283A ၏ အစားထိုးမှုသည် အင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်ချက်ကို ဖယ်ရှားပေးသည် သို့မဟုတ် ပြင်းပြင်းထန်ထန် လျော့နည်းစေပြီး ဗိုင်းရပ်စ်ပွားခြင်းကို ဖယ်ရှားပေးသည် (ပုံ 3)။ဤအကြွင်းအကျန်နှစ်ခုကို အများစု (သို့သော်လည်း အားလုံးမဟုတ်) အသိုက်အမြုံဖြစ်သော ဗိုင်းရပ်စ် (8) တွင် ထိန်းသိမ်းစောင့်ရှောက်ထားသော အရေးကြီးသော မိသားစုအလိုက် သီးခြားလုပ်ဆောင်ချက်ကို ညွှန်ပြသော၊Coronaviridae သို့မဟုတ် အခြားသော Nestioviridae မိသားစု (8) တွင် ထိန်းသိမ်းမှုမရှိသော အခြား Lys နှင့် Asp အကြွင်းအကျန်များ (K4113A, D4180A, D4197A နှင့် D4273A) ၏ Ala အစားထိုးမှုများကို ထိန်းချုပ်မှုအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ အချို့သောကိစ္စများတွင် အင်ဇိုင်းလုပ်ဆောင်မှုနှင့် ဗိုင်းရပ်စ်ကူးယူမှု အနည်းငယ်လျော့နည်းသွားသဖြင့် ဤအစားထိုးမှုများကို ကြီးမားစွာ သည်းခံနိုင်သည် (ပုံ 3 နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S3)။ယေဘုယျအားဖြင့်၊ coronavirus mutagenesis ဒေတာသည် EAV NiRAN-RdRp (16) ၏ self-GMP နှင့် ပြောင်းပြန်မျိုးရိုးဗီဇဒေတာနှင့် အလွန်ကိုက်ညီပြီး EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) အကြွင်းကျန် K94 (HCoV- 229E K4135) အရေးကြီးသောလုပ်ဆောင်ချက်များ)၊ R124 ( R4178 နှင့် သက်ဆိုင်သော )၊ D132 ( D4188 နှင့် သက်ဆိုင်သော ) D165 ( D4280 နှင့် သက်ဆိုင်သော ) F166 ( F4281 နှင့် သက်ဆိုင်သည် )။ထို့အပြင်၊ HCoV-229E mutagenesis ဒေတာသည် ယခင်ဖော်ပြခဲ့သော SARS-CoV ပြောင်းပြန်မျိုးရိုးဗီဇဒေတာ (16) မှ ကိုက်ညီပြီး ချဲ့ထွင်ထားသည့် သက်ဆိုင်ရာ CN motif Phe-to-Ala mutant SARS-CoV_nsp12 အတွက် လေ့လာတွေ့ရှိထားသူများနှင့် အလွန်ဆင်တူသည်။ ဖော်ပြထားသော phenotype -F219A နှင့် HCoV-229E_F4281A (ပုံ 3 D နှင့် E နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S3 နှင့် Table S1-S4)။
UTP နှင့် GTP (ကိုယ်တိုင် NMPylation တုံ့ပြန်မှုတွင်) ရှင်းလင်းသောဦးစားပေးမှုရှိသော EAV orthologs (16) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုအရ ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် NiRAN ဒိုမိန်း (HCoV-229E နှင့် SARS-CoV-2 တို့က ကိုယ်စားပြုသည်) သည် ထိထိရောက်ရောက်ဆောင်ရွက်နိုင်ကြောင်း ပြသသည် UMP (ပုံ 1 နှင့် 3) အတွက် အနည်းငယ်ဦးစားပေးမှု ရှိသော်လည်း NMP လေးခုစလုံးကို လွှဲပြောင်းပေးသည်။တိကျသော NTP တွဲဖက်အလွှာ၏ အနိမ့်ပိုင်းတိကျမှုမှာ ADP-Mg2+ ၏တက်ကြွသောနေရာနှင့် NiRAN ၏တက်ကြွသောနေရာနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည့် Adenine အပိုင်းနှင့်မဟုတ်ဘဲ မကြာသေးမီကဖော်ပြခဲ့သော SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 စူပါကွန်ပေါင်းဖွဲ့စည်းပုံနှင့် ကိုက်ညီသည် သီးခြားအပြန်အလှန်ဖွဲ့စည်းခြင်း (၁၇)။ကျွန်ုပ်တို့၏လေ့လာမှုတွင်၊ NMPylation တုံ့ပြန်မှုတွင်အသုံးပြုသော nucleotide အမျိုးအစားသည် မျိုးပြောင်းပရိုတိန်း၏လုပ်ဆောင်မှုအပေါ် ကွဲပြားသောအကျိုးသက်ရောက်မှုမရှိပါ (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S3)၊ ဤအကြွင်းအကျန်တစ်ခုမှ သီးခြားနျူကလီယိုဘေ့စ်တစ်ခု၏ပေါင်းစပ်မှုနှင့် နီးကပ်စွာဆက်စပ်မှုမရှိကြောင်း ညွှန်ပြပါသည်။ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်များနှင့် သွေးလွှတ်ကြောဗိုင်းရပ်များ၏ NiRAN ဒိုမိန်းများတွင် တွေ့ရှိရသော မတူညီသော NTP တွဲဖက်အလွှာဆိုင်ရာ ဦးစားပေးမှုများ၏ ဖွဲ့စည်းပုံအခြေခံနှင့် အလားအလာရှိသော ဇီဝဆိုင်ရာ ထင်ရှားမှုတို့ကို လေ့လာရန် ကျန်ရှိနေပါသည်။၎င်းတို့သည် မှန်နိုင်သည် သို့မဟုတ် ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာ လေ့လာမှုများ၏ ကန့်သတ်ချက်များကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။လက်ရှိတွင်၊ သွေးလွှတ်ကြောဗိုင်းရပ်စ် NiRAN ဒိုမိန်း၏ အလားအလာရှိသော NMPylator လုပ်ဆောင်ချက် (ယခင်က သတ်မှတ်ထားသော ကိုယ်ပိုင် NMPylation လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက) သည် သွေးလွှတ်ကြောနှင့် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်ကြား တူညီမှုကို ထည့်သွင်းစဉ်းစား၍ ကွဲပြားသော တွဲဖက်အလွှာကို ဦးစားပေးထားသည်ကို မဆုံးဖြတ်နိုင်ပါ။ NiRAN ဒိုမိန်းသည် ၎င်း၏ကန့်သတ်ချက်တွင်ရှိသည်။တစ်ဆက်တည်း အခြေခံ (၁၆) နှိုင်းယှဉ်။Mg2+ ကို cofactor အဖြစ်အသုံးပြုသည့် pseudokinase SelO နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်နှင့် သွေးလွှတ်ကြောဗိုင်းရပ်စ် NiRAN ၏လုပ်ဆောင်ချက်သည် Mn2+ (16) (ပုံ 3C နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S1) ပေါ်တွင် မူတည်ပါသည်။Mn2+ မှီခိုမှုနှင့် UTP အတွက် သိသာထင်ရှားသော ဦးစားပေးမှုသည် ပရိုတင်း NMPylators ၏ ပုံမှန်မဟုတ်သော အင်္ဂါရပ်တစ်ခုဖြစ်ပြီး မကြာသေးမီကမှ အတည်ပြုခဲ့သည့် YdiU ပရိုတင်းတွင် Salmonella typhimurium မှ တင်းကျပ်သော Mn2+-မှီခိုသော ပရိုတင်း chaperone UMPylation ကို ဆဲလ်များကို ဖိစီးမှုဖြစ်စေသော ဆဲလ် ATP ရေကန်များမှ ကာကွယ်ပေးသည် ( ၃၃)။
ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် NiRAN ဒိုမိန်းနှင့် ဆဲလ်လူလာပရိုတိန်း kinases (17, 19) အကြား မကြာသေးမီက ဖော်ပြထားသော ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ တူညီမှုသည် NiRAN ၏ NMP ကို ကျွန်ုပ်တို့တင်ပြထားသော အခြားပရိုတိန်းများနှင့် ကာဗာစီတီချိတ်ဆက်နိုင်မှုအတွက် ထပ်လောင်းပံ့ပိုးပေးပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် RTC ၏ ORF1b-ကုဒ်ဝှက်ထားသော ပုံစံတူများကို တိုက်ရိုက် သို့မဟုတ် သွယ်ဝိုက်စွာကူညီရန် သိထားသည့် HCoV-229E ORF1a မှ ကုဒ်လုပ်ထားသော ပရိုတင်းများအပေါ် ဖြစ်နိုင်ခြေ NiRAN ပစ်မှတ်များကို ကျွန်ုပ်တို့၏ရှာဖွေမှုကို အာရုံစိုက်ခဲ့ပါသည်။ကျွန်ုပ်တို့၏စမ်းသပ်ချက်များသည် nsp9 ၏ထိရောက်ပြီး တိကျသော NMPylation အတွက် ခိုင်လုံသောအထောက်အထားများပေးသည် (ပုံ 2)။အကယ်၍ ပစ်မှတ်ပရိုတင်းကို အင်ဇိုင်း (nsp12) ထက် 8 မှ 10 ဆ ပိုများသော အံသွားတွင် အသုံးပြုပါက၊ nsp9 သည် လုံးဝ (mono)NMPized (ပုံ 4) ဖြစ်ကြောင်း အတည်ပြုပါသည်။nsp12 နှင့် nsp9 အကြား အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှုသည် တိုတောင်းပြီး nsp9 (အခြား RTC အခွဲများမရှိခြင်း) နှင့် တည်ငြိမ်သောရှုပ်ထွေးမှုတစ်ခုအဖြစ် ဖြစ်ပေါ်လာမည်မဟုတ်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ကောက်ချက်ချခဲ့သည်။ဤကောက်ချက်ကို SARS-CoV proteome (35) ရှိ ပရိုတိန်း အပြန်အလှန် လေ့လာမှုများက ထောက်ခံသည်။MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် nsp9 ၏ N-terminal အကြွင်းအကျန်၏ အဓိက amine ကို NMPylation site (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S5) အဖြစ် သတ်မှတ်ခဲ့သည်။phosphoramidate bond နှင့် N-terminal amino အုပ်စုသည် NiRAN-mediated NMPylation လုပ်ဆောင်ချက်ကို Pseudomonas syringae SelO-mediated AMPylation တုံ့ပြန်မှုနှင့် Ser, Thr, သို့မဟုတ် Tyr residues Peptide adduct တွင် O-linked AMP ၏ဖွဲ့စည်းခြင်းကို အထောက်အကူဖြစ်စေသည် ( 22) နှင့် S. typhimurium YdiU သည် O-linked (Tyr) နှင့် N-linked (with) peptide-UMP adducts ပုံစံများဖြစ်သည်။SelO ပရိုတိန်းမိသားစုတွင်ရရှိနိုင်သောအကန့်အသတ်ရှိသောအချက်အလက်များသည်ဤကြီးမားသောပရိုတင်းမိသားစု၏အဖွဲ့ဝင်များသည် peptide-NMP adducts များဖွဲ့စည်းရာတွင်အလွန်ကွာခြားသည်ကိုဖော်ပြသည်။ဤသည်မှာ စူးစမ်းလေ့လာရန် ထိုက်တန်သော စိတ်ဝင်စားဖွယ်ကောင်းသော စူးစမ်းလေ့လာမှုတစ်ခုဖြစ်သည်။
ဤလေ့လာမှုတွင်ရရှိသောဒေတာသည် NMPylation ၏ NMPylation သည် N-terminus အခမဲ့လိုအပ်သည်ဟု တွေးခေါ်နိုင်စေသည်။ဗိုင်းရပ်စ်မျိုးပွားခြင်း၏အခြေအနေတွင်၊ ၎င်းကို Mpro နှင့် pp1ab တို့က ညှိနှိုင်းဆောင်ရွက်ပေးသော ပုံစံတူပိုလီပရိုတင်း pp1a ရှိ nsp8|nsp9 လုပ်ငန်းစဉ်တွင် ပရိုတိန်းဓာတ်ခွဲထွက်မှုမှ ပံ့ပိုးပေးမည်ဖြစ်သည်။ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်အများစုတွင်၊ ဤတိကျသောဆိုက် (VKLQ|NNEI in HCoV-229E) နှင့် အခြား coronavirus Mpro ခွဲထွက်သည့်နေရာများအားလုံးကြား ခြားနားချက်မှာ Asn (Ala၊ Ser Or Gly ကဲ့သို့သော အခြားအကြွင်းအကျန်အသေးစားများထက်) P1â သိမ်းပိုက်ထားခြင်းဖြစ်သည်။??တည်နေရာ (၃၆)။အစောပိုင်းလေ့လာမှုများတွင်ရရှိသော peptide ကွဲထွက်မှုဒေတာသည် nsp8|nsp9 site ၏ခွဲထွက်မှုထိရောက်မှုမှာ အခြားဆိုဒ်များထက်နိမ့်ကြောင်းပြသခဲ့ပြီး 1) ဤတိကျသောဆိုက်သည် C-terminal ၏အချိန်နှင့်တစ်ပြေးညီညှိနှိုင်းလုပ်ဆောင်ခြင်းတွင် စည်းမျဉ်းဆိုင်ရာအခန်းကဏ္ဍမှပါဝင်နိုင်သည်ကိုဖော်ပြသည်။ pp1a ဒေသ၊ သို့မဟုတ် 2) ဗိုင်းရပ်စ်ပွားခြင်းတွင် အထူးထိန်းသိမ်းထားသော nsp9 N-terminus ၏အခန်းကဏ္ဍ (37)။ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာ (ပုံ 5A) သည် အစစ်အမှန် N-terminal sequence ကိုသယ်ဆောင်လာသော nsp9 ၏ ပြန်လည်ပေါင်းစပ်ပုံစံကို nsp12 ဖြင့် ထိထိရောက်ရောက် NMP ပြုလုပ်ကြောင်းပြသခဲ့သည်။N-terminal flanking sequence ကို Factor Xa (nsp9-His6; SI appendix, Table S1) သို့မဟုတ် Mpro-mediated cleavage (nsp7-11-His6; Figure 5A နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲ၊ Table S1) ဖြင့် ဖယ်ရှားခဲ့သည်။အရေးကြီးသည်မှာ၊ nsp9-NMP adduct သည် N-terminal primary amine (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S5) နှင့် ကိုက်ညီသော NMPylation ၏ NMPylation ကို ခံနိုင်ရည်ရှိကြောင်း အရေးကြီးသည်မှာ အရေးကြီးသည်မှာ၊ မဖြတ်မတောက်ထားသော nsp9 ပါရှိသော ရှေ့ပြေးနိမိတ်သည် nsp12 ၏ NMPylation ကို ခံနိုင်ရည်ရှိကြောင်း ပြသသည်၊၊ .NiRAN အလွှာ၏ တိကျမှုကို ပိုမိုနားလည်သဘောပေါက်ရန်၊ ထို့နောက်တွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် nsp9 ၏ ကပ်လျက် N-terminal အကြွင်းအကျန်များကို အာရုံစိုက်ခဲ့ပါသည်။အခြားပရိုတင်းများမရှိသည့်အခါ၊ ၎င်းတို့သည် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံအရ ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ်ဖြစ်ပြီး ၎င်းတို့ကို တံဆိပ်မတပ်ထားသော nsp9 (26 28၊ 38) ၏ ကန့်သတ်သဘာဝကွဲလွဲမှုကို ညွှန်ပြသော တံဆိပ်မတပ်ထားသော ပုံစံတွင် ၎င်းတို့အား ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းမှ တားဆီးနိုင်သည်၊ ဤသည်မှာ အရေးကြီးသော sequence-specific (သာမညဖွဲ့စည်းပုံနှင့်သက်ဆိုင်သော) ကြောင့်ဖြစ်သည်။ nsp9 N-terminal fragment ၏လုပ်ဆောင်ချက်။ဤဒေသရှိ ထိန်းသိမ်းထားသော အကြွင်းအကျန်များ၏ Ala အစားထိုးမှုများ (ပုံ 5C နှင့် D နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲ၊ Figure S8) သည် N3826 သည် nsp9 NMPylation ဗီထရိုအတွက် မရှိမဖြစ်ဖြစ်ကြောင်း ထင်ရှားစေပြီး N3825A နှင့် E3827A အစားထိုးမှုများသည် NMPylation လျော့နည်းသွားစေရန် ဦးတည်နေပြီး M3829A နှင့် P383 အစားထိုးမှုများ မလုပ်နိုင်ပါ။ .nsp9 NMPylation ကို ထိခိုက်စေသည်မှာ သိသာသည်။N-terminal Asn (N3825A, N3825S) ၏ အစားထိုးမှုသည် nsp9 NMPylation နှင့် ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှု (ပုံ 5C နှင့် D) တွင် ဗိုင်းရပ်စ်ပွားခြင်းအပေါ် အလယ်အလတ်အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိသော်လည်း N-terminal 3825-NN dipeptide မှ Asn အကြွင်းအကျန်အစီအစဥ်ကို ဖျက်ခြင်း N-terminus တွင် အခြားအကြွင်းအကျန်များ မတိုင်မီ Asn အကြွင်းအကျန်တစ်ခု လိုအပ်ကြောင်း သက်သေပြခဲ့ပြီး၊ အလားတူ အကြွင်းအကျန်များ၏ အစားထိုးမှုကို တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း သည်းခံနိုင်ပုံရသည် (ပုံ 5B၊ C နှင့် D) တို့ကို ဗိုင်းရပ်စ်များသေစေကြောင်း သက်သေပြခဲ့သည်။အထူးသဖြင့် 3825-NN dipeptide သည် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်အကွာအဝေးအတွင်း ထိန်းသိမ်းထားသောနှင့် မရှိမဖြစ်လိုအပ်သော N3826 အကြွင်းအကျန် (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S6) သည် NiRAN ၏တက်ကြွသောဆိုက်ရှိ nsp9 N-terminus ၏ မှန်ကန်သောစည်းနှောင်မှုနှင့် တိမ်းညွှတ်မှုကို သေချာစေသည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ကောက်ချက်ချပါသည်။
မိသားစုခွဲအားလုံး၏ ထိန်းသိမ်းထားသော Glu အတွက် Ala (E3827A) ကို အစားထိုးခြင်းသည် nsp9 NMPylation ဗီထရိုတွင် ထိန်းသိမ်းထားသော်လည်း ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုရှိ ဗိုင်းရပ်စ်များသေစေသည် (ပုံ 5C နှင့် D)၊ ဥပမာ၊ အဓိက အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများတွင် (NMPylated သို့မဟုတ် မပြုပြင်ရသေးသော ဗိုင်းရပ်စ်များ)၊ ) nsp9 N-terminus နှင့် ဗိုင်းရပ်စ်ပွားခြင်းတွင် ပါ၀င်သော အခြားအချက်များ။Nsp9 ဗီဇပြောင်းလဲမှုများသည် nsp9 ၏ proteolytic လုပ်ငန်းစဉ် သို့မဟုတ် ကပ်လျက် nsps (39) (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S9) ကို မထိခိုက်စေဘဲ လေ့လာတွေ့ရှိရသော nsp9 ဗီဇပြောင်းလဲမှုအများအပြား၏ သေစေသော phenotypes များသည် C proteolytic လုပ်ငန်းစဉ်-terminal pp1a ဧရိယာ၏ ချို့ယွင်းချက်ကြောင့်မဟုတ်ကြောင်း ညွှန်ပြပါသည်။ .
အထက်ပါအချက်အလက်များသည် pp1a/pp1ab ရှိ nsp8|9 ခွဲထွက်ရေးဆိုက်၏ Mpro-ဖျန်ဖြေကုသပြီးနောက်၊ nsp9 ၏ N-terminus ကို UMPylated (သို့မဟုတ် အခြား NMP ဖြင့် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းမွမ်းမံထား) ကြောင်း အထောက်အထားများ ပေးပါသည်။ထို့အပြင်၊ nsp9 ၏ N-terminus ၏ကောင်းမွန်သောထိန်းသိမ်းမှုသည် ( coronavirus မိသားစုရှိ အနည်းကိန်းနှင့်မတူညီသော Asn အကြွင်းအကျန်များအပါအဝင်) နှင့် ဤလေ့လာမှုတွင်ရရှိသော ပြောင်းပြန်မျိုးရိုးဗီဇဒေတာ (ပုံ 3E နှင့် 5D) သည် ဖော်ပြထားသည့် nsp9 NMPylation ကိုကောက်ချက်ချနိုင်စေခဲ့သည်။ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာနှင့် ဆက်စပ်ပြီး ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်ပွားခြင်းအတွက် မရှိမဖြစ်လိုအပ်ပါသည်။ဤမွမ်းမံမှု၏ လုပ်ငန်းဆောင်တာအကျိုးဆက်များကို ယခင်ဖော်ပြထားသော (အတိအကျမဟုတ်သော) nsp9 (မွမ်းမံထားသောပုံစံ) RNA binding လုပ်ဆောင်မှု (2628) နှင့်ပတ်သက်၍ လေ့လာရန်ကျန်ရှိနေသေးသည်။N-terminal NMPylation သည် ပရိုတိန်း သို့မဟုတ် RNA အလွှာများနှင့် nsp9 ၏အပြန်အလှန်အကျိုးသက်ရောက်မှု သို့မဟုတ် မတူညီသောအဆင့်လေးဆင့်စုပေါင်းများဖွဲ့စည်းခြင်းကိုလည်း သက်ရောက်မှုရှိနိုင်သည်။ဤမွမ်းမံမှုကိစ္စတွင် အထူးသဖြင့် ဤမွမ်းမံမှုတွင်မရှိသော်လည်း၊ ဤအရာများကို ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာလေ့လာမှုများတွင် တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်ပွားခြင်းနှင့် ပတ်သက်ကြောင်း အတည်ပြုထားသည်။
ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် NiRAN ဒိုမိန်း၏ ပစ်မှတ်တိကျမှုမှာ ပိုမိုအသေးစိတ်ဖော်ပြရန် လိုအပ်နေသေးသော်လည်း၊ ကျွန်ုပ်တို့၏အချက်အလက်များသည် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် NiRAN ဒိုမိန်း၏ ပရိုတင်းရည်မှတ်သတ်မှတ်မှုမှာ အလွန်ကျဉ်းမြောင်းကြောင်း ပြသပါသည်။nidovirus မိသားစုအားလုံး၏ NiRAN ဒိုမိန်းရှိ အဓိကတက်ကြွသောဆိုက်အကြွင်းအကျန်များ (8, 16) ကို ထိန်းသိမ်းခြင်းသည် ထိန်းသိမ်းထားသော NMPylator ၏လုပ်ဆောင်မှုကို အခိုင်အမာ ထောက်ခံသော်လည်း၊ ဤဒိုမိန်း၏ အလွှာတွဲအိတ်ကပ်အကြွင်းအကျန်များ၏ အထောက်အထားကို ထိန်းသိမ်းရေးနှင့် ထိန်းသိမ်းရေးသည် သွင်ပြင်လက္ခဏာအဖြစ် ဆက်လက်တည်ရှိနေပါသည်။ နှင့် Nidovirales ရည်ရွယ်ချက်များ၏ မတူညီသော မိသားစုများအကြား ကွဲပြားနိုင်သည်။အလားတူ၊ အခြားသော nested virus များ၏ သက်ဆိုင်ရာ ပစ်မှတ်များကို မသတ်မှတ်ရသေးပါ။၎င်းတို့သည် nsp9 သို့မဟုတ် အခြားပရိုတိန်းများ၏ ဝေးလံခေါင်သီသော orthologs များ ဖြစ်နိုင်သည်၊ အကြောင်းမှာ၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် ၎င်းတို့သည် Mpro နှင့် NiRAN ကြားရှိ ဂျီနိုမ်ခင်းကျင်းခြင်းအပါအဝင် (8) ဗိုင်းရပ်စ်များတွင် ယေဘုယျအားဖြင့် သိုက်ဗိုင်းရပ်များတွင် ထိန်းသိမ်းထားသော ပုံစံတူဒိုမိန်းငါးခု၏ အပြင်ဘက်တွင် ထိန်းသိမ်းမှုနည်းသောကြောင့် (8)၊ ကိုရိုနာ ဗိုင်းရပ်စ်။
ထို့အပြင်၊ NiRAN ဒိုမိန်းတွင် နောက်ထပ် (ဆယ်လူလာအပါအဝင်) ပစ်မှတ်များပါရှိသည်ဟူသော ဖြစ်နိုင်ခြေကို လောလောဆယ် ကျွန်ုပ်တို့ မငြင်းနိုင်ပါ။ဤကိစ္စတွင်၊ ဤပေါ်ပေါက်လာသောပရိုတိန်း NMPylators (NMPylators) (30၊ 31) တွင် "မာစတာအားထိန်းသူများ" ရှိပုံရသည်ကို မှတ်သားထိုက်ပါသည်။NMP သည် ၎င်းတို့၏ အောက်ပိုင်းလှုပ်ရှားမှုများကို ထိန်းညှိရန် သို့မဟုတ် ဖယ်ရှားရန် ဆဲလ်လူလာပရိုတင်းမျိုးစုံကို ပြုပြင်ပေးသည်၊ ထို့ကြောင့် ဆဲလ်လူလာစိတ်ဖိစီးမှုတုံ့ပြန်မှုနှင့် redox homeostasis ကဲ့သို့သော ဇီဝဖြစ်စဉ်အမျိုးမျိုးတွင် အခန်းကဏ္ဍတစ်ခုမှ ပါဝင်နေသည်။
ဤလေ့လာမှုတွင် (ပုံ 2 နှင့် 4 နှင့် SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ S3 နှင့် S5) တွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် nsp12 မှ UMP (NMP) အပိုင်းကို nsp9 တွင် တစ်ခုတည်း (ထိန်းသိမ်းထားသော) အနေအထားသို့ လွှဲပြောင်းပေးခဲ့ကြောင်း သက်သေပြနိုင်ခဲ့ပြီး အခြားပရိုတိန်းများကို ပြုပြင်မွမ်းမံထားခြင်းမရှိပေ။ အသုံးပြုထားသော အခြေအနေများအောက်တွင်၊ ကောင်းစွာသတ်မှတ်ထားသော (လျော့ရဲနေမည့်အစား) အလွှာ၏တိကျမှုကို ပံ့ပိုးထားသည်။၎င်းနှင့်ကိုက်ညီသည်၊ N-terminal nsp9 NMPylation နှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက၊ nsp12 ၏ကိုယ်ပိုင် NMPylation လုပ်ဆောင်ချက်သည် အလွန်နည်းပါးသည်၊ ၎င်း၏ရှာဖွေတွေ့ရှိမှုသည် ပိုရှည်သော autoradiography ထိတွေ့မှုအချိန်လိုအပ်ပြီး nsp12 အာရုံစူးစိုက်မှု 10 ဆတိုးလာမှုကိုအသုံးပြုသည်။ထို့အပြင်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာချက်သည် NMPylation ၏ nsp12 အတွက် သက်သေမပြနိုင်ဘဲ၊ NiRAN ဒိုမိန်းကိုယ်တိုင် NMPylation သည် (အကောင်းဆုံး) ဒုတိယလုပ်ဆောင်ချက်ဖြစ်ကြောင်း အကြံပြုထားသည်။သို့သော်လည်း အခြားလေ့လာမှုများက ဘက်တီးရီးယား NMPylator ၏ self-AMPylation အခြေအနေသည် အခြားပရိုတိန်းအလွှာများတွင် ၎င်းတို့၏ NMPylation လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းချုပ်နိုင်သည်ဟု ပဏာမအထောက်အထားများ ပေးထားကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။ထို့ကြောင့် EAV nsp9 (16) နှင့် coronavirus nsp12 (ဤလေ့လာမှု) အတွက် C-terminal RdRp domain ၏ခေါက်ခြင်းအပေါ်အဆိုပြုထားသော chaperone-like effect အပါအဝင် EAV nsp9 (16) နှင့် coronavirus nsp12 (ဤလေ့လာမှု) တို့၏ ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော functional Effects များကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန် နောက်ထပ်သုတေသနပြုရန်လိုအပ်ပါသည်။ ၁၆))။
ယခင်က၊ RNA ligase၊ RNA -capped guanylate transferase နှင့် protein priming လုပ်ဆောင်မှု (16) အပါအဝင် nidoviral NiRAN ဒိုမိန်း၏ ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော အောက်ပိုင်းလုပ်ဆောင်ချက်များနှင့်ပတ်သက်သော ယူဆချက်အများအပြားကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားခဲ့ကြသော်လည်း ၎င်းတို့အနက်မှ ရရှိနိုင်သော downstream လုပ်ဆောင်ချက်များနှင့် ကိုက်ညီမှုမရှိပါ။အောက်ပါရာထူးများတွင်ရရှိသောအချက်အလက်များသည် ထပ်လောင်းယူဆချက်များမပြုလုပ်ဘဲ အတိအကျတူညီပါသည်။ဤလေ့လာမှုတွင်ရရှိသောဒေတာသည် NiRAN ဒိုမိန်းသည် ပရိုတင်း-ဖြစ်ပေါ်စေသော RNA ပေါင်းစပ်မှုစတင်ခြင်းတွင်ပါဝင်ကြောင်း (သို့သော်သက်သေမပြနိုင်ပါ) နှင့် အကိုက်ညီဆုံးဖြစ်သည်။5 တွင် NiRAN ဒိုမိန်း၏လုပ်ဆောင်ချက်ကိုယခင်ကယုံကြည်ခဲ့သည်။²-RNA capping သို့မဟုတ် RNA ligation တုံ့ပြန်မှုများသည် ၎င်းတို့နှင့် အခြားဒေတာများ၏ ပံ့ပိုးမှုမှ သက်ရောက်မှုမရှိပါ။ထို့ကြောင့်၊ ဥပမာအားဖြင့်၊ NiRAN ၏တက်ကြွသောဆိုက်တွင် ယေဘုယျအခြေခံအဖြစ် ထိန်းသိမ်းထားသော Asp ပါ၀င်သည်ဟု ယူဆသည် (D252 in Pseudomonas syringae SelO; D4271 in HCoV-229E pp1ab; D208 in SARS-CoV-2 nsp12) (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ပုံ 2 )S2) (17၊ 22၊ 33)၊ ATP-dependent RNA ligase နှင့် RNA capping enzyme တွင် catalysis ကို covalent enzyme-(lysyl-N)-NMP အလယ်အလတ်ဖြစ်သော၊ မပြောင်းလဲထားသော Lys အကြွင်းအကျန်များပါ၀င်သည် ( ၄၁)။ထို့အပြင်၊ ထိန်းသိမ်းထားသော ပရိုတိန်းပစ်မှတ်များအတွက် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ် NiRAN ၏ ထူးထူးခြားခြား အစီအစဥ်အခြေခံသော သီးခြားထူးခြားချက်နှင့် NTP တွဲဖက်အလွှာအတွက် (UTP ကိုနှစ်သက်သည်) အတွက် ဖြေလျှော့ပေးသည့် သီးခြားထူးခြားချက်သည် NiRAN-mediated capping enzyme သို့မဟုတ် RNA ligase ကဲ့သို့သော လုပ်ဆောင်ချက်များကို ဆန့်ကျင်သည်။
သေချာသည်မှာ၊ အတည်ပြုရန် အပိုအလုပ်များစွာလိုအပ်ပြီး၊ သက်သေပြပါက၊ ပရိုတင်းမှဖြစ်စေသော RNA ပေါင်းစပ်မှုတွင် ဖြစ်နိုင်ခြေရှိသော nsp9-UMP (nsp9-NMP) အခန်းကဏ္ဍကို အသေးစိတ်ရှင်းပြပါ၊ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသော်လည်း (ယခုအချိန်အထိ) အစီရင်ခံစာများစွာကို ချိတ်ဆက်ပေးမည့်၊ .ခွဲထုတ်ပစ်ပြီး။ဥပမာအားဖြင့်၊ ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်စ်၏ အနုတ်လက္ခဏာ RNA ၏အဆုံးသည် oligo(U) ကြိုးမျှင် (42၊ 43) ဖြင့် စတင်သည်ဟု ဆုံးဖြတ်ထားသည်။ဤလေ့လာတွေ့ရှိချက်သည် အနုတ်လိုင်း RNA ၏ UMPylated ပုံစံ nsp9 ကို ပေါင်းစည်းထားသည့် poly(A) အမြီး (အစပျိုးမှုများ) နှင့် ၎င်း၏ RNA ချိတ်ဆက်မှုဖြင့် မြှင့်တင်နိုင်သည်ဟူသော အယူအဆနှင့် ကိုက်ညီပါသည်။ အခြား RTC ပရိုတင်း။ထို့နောက် nsp9 မှပံ့ပိုးပေးသော UMP အပိုင်းကို nsp7/8/nsp12-mediated oligouridylation အတွက် "primer" အဖြစ်အသုံးပြုနိုင်ပြီး 3??²-poly(A) အမြီးကို genomic RNA သို့မဟုတ် အခြား oligo (A) ပါဝင်သော sequence ရှိ picornavirus VPg ပရိုတင်း (44) အတွက် တည်ထောင်ထားသော ယန္တရားနှင့် ဆင်တူသော ပုံစံခွက်တစ်ခုအဖြစ် လုပ်ဆောင်သည်။အဆိုပြုချက်သည် "ပုံမှန်မဟုတ်သော" ဖြစ်ပါက မည်သို့နည်း။???(protein-induced) negative-strand RNA synthesis ၏အစပြုမှုသည် လေ့လာတွေ့ရှိချက်များဆီသို့ လင့်ခ်တစ်ခုပေးသည်၊၊ ကိုရိုနာအနုတ်-ကြိုး RNA တွင် ၎င်း၏အဆုံးတွင် UMP (UTP အစား) ရှိသည် (42) ကိုညွှန်ပြသည်ဟုယူဆရသော၊ nucleic acid Dicer သည် အမည်မသိ uridine-specific endonuclease ဖြင့် phosphorylated အဆုံးကို ဖြတ်သည်။အတည်ပြုပါက၊ ဤ nucleic acid hydrolytic လုပ်ဆောင်ချက်သည် အခြေတည်သော အနုတ်ကြိုးမျှင်၏ 5 ² အဆုံးမှ oligomeric UMPylated ပုံစံ nsp9 ကို ထုတ်လွှတ်ပေးရန် ကူညီပေးနိုင်ပါသည်။nsp9 (နှင့် nsp8) သည် ကိုရိုနာ ဗိုင်းရပ်စ် ဂျီနိုမ်၏ အဆုံး 3 စွန်းအနီးတွင် ထိန်းသိမ်းထားသော cis-acting RNA ဒြပ်စင်နှင့် ပြင်းထန်စွာ တုံ့ပြန်ကြောင်း ပြသသည့် ယခင် ပြောင်းပြန်မျိုးရိုးဗီဇ လေ့လာမှုများနှင့်လည်း ကိုက်ညီမှုရှိနိုင်ခြေရှိသော nsp9 ၏ အခန်းကဏ္ဍသည် ကိုက်ညီပါသည်။၄၅)။ဤအစီရင်ခံစာအရ၊ ဤယခင်လေ့လာတွေ့ရှိချက်များကို ယခုထပ်မံ၍ သုတေသနပြုခြင်းဖြင့် ပြန်လည်ဆန်းစစ်နိုင်မည်ဖြစ်သည်။
အချုပ်အားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ဒေတာသည် N-terminus ရှိ RdRp နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော မူပိုင် nested virus အင်ဇိုင်းတက်ဂ်၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကို ဆုံးဖြတ်ပါသည်။ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်တွင်၊ အသစ်တွေ့ရှိထားသော NiRAN-mediated UMPylator/NMPylator လုပ်ဆောင်ချက်ကို Mn2+ နှင့် ကပ်လျက် Asn အကြွင်းအကျန်များကို အားကိုးပြီး N-terminal ပင်မ amine နှင့် (စွမ်းအင်နည်း) phosphoramidate နှောင်ကြိုးများဖွဲ့စည်းခြင်းကို ဖြစ်စေသည်။nsp8|9 ခွဲထွက်ရေးဆိုက်ရှိ Mpro-mediated cleavage မှတဆင့်၊ NMPylation အတွက် nsp9 ပစ်မှတ်ကို အသုံးပြုနိုင်ပြီး RdRp အထိ တိုးချဲ့ထားသည့် protease နှင့် NiRAN ဒိုမိန်းကြားတွင် လုပ်ဆောင်နိုင်သော ချိတ်ဆက်မှုကို ညွှန်ပြသည်။SARS-CoV-2 အပါအဝင် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်နှစ်ခုမှရရှိသော ဒေတာနှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော nsp12 NiRAN တက်ကြွသောဆိုက်နှင့် nsp9 ပစ်မှတ်ရှိ အဓိကအကြွင်းအကျန်များကို ထိန်းသိမ်းခြင်းသည် nsp9 NMPylation သည် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်စ် ကွန်ဆာဗေးတစ်အသွင်ဆောင်သည့် ဗိုင်းရပ်စ်မျိုးပွားခြင်းအတွက် အဓိကခြေလှမ်းဖြစ်ကြောင်း ခိုင်လုံသောအထောက်အထား ပေးပါသည်။ရရှိနိုင်သောအချက်အလက်များသည် ပရိုတိန်းထုတ်လုပ်သော RNA ပေါင်းစပ်မှုတွင် NMPylated ပုံစံ nsp9 ၏ သီးခြားအခန်းကဏ္ဍသည် ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်များနှင့် အခြားအသိုက်အမြုံဗိုင်းရပ်စ်များအတွက် ကျိုးကြောင်းဆီလျော်သည့်အခြေအနေဖြစ်ပြီး NiRAN သည်လည်း အခြားအမည်မသိပရိုတင်းများကို ပစ်မှတ်ထားနိုင်သည်။ဗိုင်းရပ်စ်ကို ထိန်းညှိပါ။လက်ခံဆောင်ရွက်ပေးခြင်း။အတည်ပြုပါက၊ ဗိုင်းရပ် RNA ပေါင်းစပ်မှုတွင် ပရိုတင်းပရိုတင်းပရိုတင်းများပါ၀င်မှုသည် မကြာသေးမီကတွေ့ရှိခဲ့သော ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်နှင့် picornavirus ကဲ့သို့သော စူပါအုပ်စု (9) အကြားတွင် စုစည်းထားသော Mpro/3CLpro နှင့် RdRp ဒိုမိန်းများ၏ စီစဥ်ဆက်နွယ်မှုကို တိုးစေမည်ဖြစ်သည်။ 46) အမျိုးအစား။
ဤလေ့လာမှုတွင်ဖော်ပြထားသော အခြေခံ၊ ရွေးချယ်မှုနှင့် ရှေးရိုးဆန်သော အင်ဇိုင်းလှုပ်ရှားမှုများကို ဗိုင်းရပ်စ်ဆန့်ကျင်ဆေးများအတွက် ပစ်မှတ်အဖြစ် အသုံးပြုနိုင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့၏အချက်အလက်များကိုလည်း ပြသထားသည်။NiRAN ၏တက်ကြွသောနေရာရှိ nsp9 N-terminus ၏ထိန်းသိမ်းထားသော nsp9 N-terminus ၏ချည်နှောင်ခြင်း (နှင့်နောက်ဆက်တွဲပြုပြင်မွမ်းမံမှု) ကိုအနှောင့်အယှက်ဖြစ်စေသောဒြပ်ပေါင်းများကိုထိရောက်ပြီးစွယ်စုံနိုင်သောဗိုင်းရပ်စ်ပိုးသတ်ဆေးများအဖြစ်ဖန်တီးနိုင်သည်၊ တိရစ္ဆာန်နှင့်လူသားကိုရိုနာဗိုင်းရပ်များကိုကုသရန်အတွက်သင့်လျော်သော၊ ကွဲပြားသော (ခွဲ) မျိုးရိုးကူးစက်မှုမှ SARS-CoV-2 နှင့် Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus အပါအဝင်။
ဤလေ့လာမှုတွင်ထုတ်လုပ်သည့် coronavirus ပရိုတင်း၏ကုဒ်နံပါတ်ကို RT-PCR က ချဲ့ထွင်ပြီး SARS-CoV-2 ကူးစက်ခံထားရသော Huh-7 မှခွဲထုတ်ထားသည့် RNA မှခွဲထုတ်ထားသော RNA ကိုအသုံးပြု၍ SARS-CoV-2 သို့မဟုတ် Vero E6 နှင့် စံပြုပုံတူပွားခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်များကို ထည့်သွင်းထားသည်။pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) သို့မဟုတ် pASK3-Ub-CHis6 (47) expression vector (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ Tables S1 နှင့် S2)။တစ်ခုတည်းသော codon အစားထိုးမှုများကို PCR-based site-directed mutagenesis (48) မှမိတ်ဆက်ခဲ့သည်။MBP ပေါင်းစပ်ပရိုတင်းကို ထုတ်လုပ်ရန်အတွက် အီးကိုလီ TB1 ဆဲလ်များကို သင့်လျော်သော pMAL-c2 plasmid တည်ဆောက်ပုံ (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ဇယား S1) ဖြင့် ပြောင်းလဲခဲ့သည်။ပေါင်းစပ်ပရိုတင်းကို amylose affinity chromatography ဖြင့် သန့်စင်ပြီး factor Xa ဖြင့် ထုလုပ်ထားသည်။နောက်ပိုင်းတွင်၊ ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း C-terminal His6-tagged ပရိုတင်းအား Ni-immobilized metal affinity chromatography (Ni-IMAC) ဖြင့် သန့်စင်ခဲ့သည်။ubiquitin ပေါင်းစပ်ပရိုတင်းကို ထုတ်လုပ်ရန်အတွက် E. coli TB1 ဆဲလ်များသည် သင့်လျော်သော pASK3-Ub-CHis6 plasmid တည်ဆောက်ပုံ (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ Tables S1 နှင့် S2) နှင့် pCGI plasmid DNA ကုဒ်ဖြင့် ubiquitin-specific C-terminal hydrolase 1 (Ubp1) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။အသွင်ပြောင်း (၄၇)။C-terminal His6-tagged ကိုရိုနာဗိုင်းရပ်ပရိုတိန်းသည်ယခင်ဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း (50) ကိုသန့်စင်ခဲ့သည်။
HCoV-229E nsp12-His6 ၏ self-NMPylation စမ်းသပ်မှုကို EAV nsp9 (16) တွင် ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ nsp12-His6 (0.5 µM) တွင် 50 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)-KOH၊ pH 8.0၊ 5 mM dithiothreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µbcu buffer ပါရှိသည်။ သတ်မှတ်ထားသော NTP နှင့် 0.17 µM သည် [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) 30°C တွင် မိနစ် 30 ကြာ ကိုက်ညီပါသည်။nsp12-mediated nsp9 NMPylation ၏အခြား (စံ) NMPylation စစ်ဆေးမှုအားလုံးတွင်၊ တုံ့ပြန်မှုအခြေအနေများကို အောက်ပါအတိုင်း ချိန်ညှိထားသည်- nsp12-His6 (0.05 µM) နှင့် nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH 8.0) ပါဝင်နေပါသည်။ ) 5 mM DTT၊ 1 mM MnCl2၊ 25 µM ညွှန်ပြသော NTP နှင့် 0.17 µM သည် [α32-P]NTP နှင့် ကိုက်ညီသည်။30°C တွင် 10 မိနစ်ကြာ ပေါက်ဖွားပြီးနောက်၊ တုံ့ပြန်မှုနမူနာကို SDS-PAGE နမူနာကြားခံ- 62.5 mM tris(hydroxymethyl)aminomethane HCl (pH 6.8)၊ 100 mM DTT၊ 2.5% SDS၊ 10% glycerol နှင့် bromophenol 0.005% အပြာ။ပရိုတင်းကို 90°C တွင် 5 မိနစ်အပူပေးပြီး 12% SDS-PAGE ဖြင့် ခွဲခြားထားသည်။ဂျယ်ကို Coomassie Brilliant Blue ဖြေရှင်းချက် (40% မီသနော၊ 10% acetic acid၊ 0.05% Coomassie Brilliant Blue R-250) ဖြင့် ပြင်ဆင်ပြီး စွန်းထင်းနေကာ အရောင်ပြောင်းကာ မီးစုန်းဓါတ်ပုံစခရင်ကို နာရီ 20 ကြာ ထိတွေ့ထားသည် (NMPylation မှ nsp12 ကိုသိရှိရန်) သို့မဟုတ် (အများဆုံး) 2 နာရီ (nsp9 NMPylation အကဲဖြတ်ရန်)။Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) ကို စခရင်ကို စကင်န်ဖတ်ရန် အသုံးပြုခဲ့ပြီး ImageJ ကို signal intensity ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။
MS ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ 1 µM nsp12-His6 နှင့် 10 µM nsp9 (hexahistidine တဂ်မပါဘဲ) ကို NMPylation ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (SI နောက်ဆက်တွဲ၊ ဇယား S1) တွင်အသုံးပြုပြီး 500 µM UTP နှင့် GTP ၏ ပြင်းအားကို တိုးမြှင့်အသုံးပြုခဲ့သည်။၎င်းတို့၏ အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် မျှော်မှန်းထားသော ပရိုတင်းအရည်အသွေးပေါ်မူတည်၍ MassPrep ကော်လံ (Waters) တပ်ဆင်ထားသော Waters ACQUITY H-Class HPLC စနစ်အား အွန်လိုင်းတွင် 1 မှ 10 µL အား buffered ပရိုတင်းဖြေရှင်းချက်များအား ဖယ်ရှားရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်။အဆိုပါ desalted ပရိုတင်းအား Synapt G2Si အစုလိုက်အပြုံလိုက်တိုင်းတာမှု (Waters) ၏ လျှပ်စစ်စပရေးဖြန်းအိုင်းရင်းရင်းမြစ်ထဲသို့ ဖယ်ထုတ်လိုက်ပြီး ကော်လံအပူချိန်သည် ကော်လံအပူချိန်ဖြစ်သည်။ 60°C နှင့် 0.1 mL/min စီးဆင်းမှုနှုန်း- 5% A ကို 2 မိနစ်ကြာ အထီးကျန်ဆန်စွာ ထုတ်ယူပြီးနောက် 8 မိနစ်အတွင်း linear gradient မှ 95% B သို့ 95% B ကို နောက်ထပ် 4 မိနစ်ကြာ ထိန်းသိမ်းပါ။
ဒြပ်ထု 500 မှ 5000 m/z ရှိသော အပြုသဘောဆောင်သော အိုင်းယွန်းများကို တွေ့ရှိသည်။Glu-fibrinopeptide B သည် အလိုအလျောက် အစုလိုက်အပြုံလိုက် ပျံ့လွင့်မှုကို ပြုပြင်ရန်အတွက် 45 စက္ကန့်တိုင်းတိုင်းသည်။အခြေခံလိုင်းကို နုတ်ပြီး ချောချောမွေ့မွေ့ ဖြတ်ပြီးနောက် ပျမ်းမျှ ရောင်စဉ်ကို ရပ်တန့်ရန် MaxEnt1 တိုးချဲ့မှုဖြင့် MassLynx တူရိယာဆော့ဖ်ဝဲကို အသုံးပြုပါ။
UMPylated HCoV-229E nsp9 ကို sequencing-grade modified trypsin (Serva) ကို ပေါင်းထည့်ကာ 37°C တွင် ညတွင်းချင်း ပေါက်ဖွားခြင်းဖြင့် ကြေညက်သွားပါသည်။Chromabond C18WP လှည့်ကွက်ကော်လံ (အပိုင်းနံပါတ် 730522; Macherey-Nagel) ကို peptides များကို ဖယ်ရှားပြီး အာရုံစူးစိုက်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။နောက်ဆုံးတွင်၊ peptide ကို ရေ 25 µL တွင် ပျော်ဝင်ခဲ့ပြီး 5% acetonitrile နှင့် 0.1% formic acid ပါ၀င်သည်။
နမူနာများကို Orbitrap Velos Pro mass spectrometer (Thermo Scientific) အသုံးပြု၍ MS မှ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ပါသည်။စိတ်ကြိုက်အဆုံးတပ်ဆင်ထားသော 50 စင်တီမီတာရှိသော အဆုံးစွန်သော နာနို HPLC စနစ် (Dionex)၊75 μm C18 RP ကော်လံသည် 2.4 μm သံလိုက်ပုတီးများဖြင့်ထုပ်ပိုးထားသော (Dr. Albin Maisch စွမ်းဆောင်ရည်မြင့် LC GmbH) Proxeon nanospray ရင်းမြစ်မှတဆင့် အွန်လိုင်းမှ အစုလိုက်အပြုံလိုက် spectrometer သို့ ချိတ်ဆက်ပါ။300 µm အတွင်းအချင်း × ??1 စင်တီမီတာ C18 PepMap ကြိုတင်အာရုံစူးစိုက်မှုကော်လံ (အပူသိပ္ပံနည်းကျ)။ရေ/ 0.05% ဖော်မစ်အက်ဆစ်ကို ရည်ညွှန်းချက်အဖြစ် အသုံးပြု၍ နမူနာအား အလိုအလျောက်ပိတ်မိကာ စီးဆင်းမှုနှုန်း 6 µL/min ဖြင့် စွန့်ထုတ်ခဲ့သည်။
အောက်ဖော်ပြပါ gradients များ၏ ရေ/ 0.05% ဖော်မစ်အက်ဆစ် (solvent A) နှင့် 80% acetonitrile/ 0.045% formic acid (solvent B) ကို tryptic peptides ၏ စီးဆင်းမှုနှုန်း 300 nL/min တွင် ခွဲထုတ်ရန်အတွက် အသုံးပြုခဲ့သည်- 4% B အတွက်၊ 5 မိနစ်၊ ထို့နောက် မိနစ် 30 အတွင်း A linear gradient မှ 45% B သို့ 5 မိနစ်အတွင်း linear မှ 95% solvent B သို့ တိုးလာပါသည်။ခရိုမာတိုဂရပ်ဖစ်ကော်လံကို stainless steel nano-emitter (Proxeon) နှင့် ချိတ်ဆက်ပြီး 2,300 V အလားအလာကို အသုံးပြု၍ အပူပေးထားသော အစုလိုက်အပြုံလိုက်အကြောသို့ တိုက်ရိုက်ဖြန်းပါ။ Orbitrap အစုလိုက်အပြုံလိုက်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် 60,000 resolution ရှိသော စစ်တမ်းကို စကင်န်ဖတ်ခြင်းသည် ဆက်စပ်နေသည် အနည်းဆုံးဒေတာ MS/MS စကန်ဖတ်မှု သုံးခုဖြင့် စက္ကန့် 30 ကြာ ဒိုင်းနမစ်ဖြင့် ဖယ်ထုတ်ထားသော၊ linear ion trap သည် တိုက်မိမှုဖြစ်စေသော induced dissociation သို့မဟုတ် ပိုမိုမြင့်မားသော energy collision dissociation သို့မဟုတ် orbitrap detection နှင့်ပေါင်းစပ်ထားသော ကြည်လင်ပြတ်သားမှုမှာ 7,500 ဖြစ်သည်။
စာတိုက်အချိန်- သြဂုတ်-၀၃-၂၀၂၁